LNPs作為當(dāng)前最先進(jìn)的非病毒基因治療載體，已成功應(yīng)用于多種核酸的遞送，包括siRNA、miRNA、mRNA以及質(zhì)粒DNA和Cas9-sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物。然而，實(shí)現(xiàn)LNPs在肝外器官的細(xì)胞特異性遞送仍是一個(gè)尚未解決的難題。多肽因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為L(zhǎng)NPs修飾的理想靶向配體。

近期，美國(guó)加利福尼亞大學(xué)Ester J. Kwon團(tuán)隊(duì)在Journal of Controlled Release上發(fā)表題為“Formulation methods for peptide-modified lipid nanoparticles”的研究。本文旨在比較后修飾靶向法（PCT）和在線修飾靶向法（ILT）多肽修飾LNPs的制備方法，以評(píng)估其對(duì)LNPs功能特性的影響。

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Fig. 1. Formulation of peptide targeted LNPs through in-line or post-modification with five different peptide ligands.

體外轉(zhuǎn)染效率、結(jié)合與攝取
研究以cRGD為例，評(píng)估了不同修飾量（0、0.17、0.3和0.5 mol%）對(duì)LNP轉(zhuǎn)染效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著cRGD修飾量的增加，LNP的轉(zhuǎn)染效率逐漸提高，在0.5 mol% cRGD修飾時(shí)達(dá)到最高轉(zhuǎn)染效率，比未修飾時(shí)提高21倍（圖2E）。進(jìn)一步比較PCT和ILT法制備的0.5 mol% cRGD修飾LNPs，發(fā)現(xiàn)PCT法制備的LNP轉(zhuǎn)染效率是ILT法的兩倍以上（圖2F）。

Fig. 2. Activity of peptide LNPs created through inline or post-modification

為了理解PCT和ILT法制備的LNP在轉(zhuǎn)染效率上的差異，研究評(píng)估了它們?cè)?°C（僅結(jié)合）和37°C（結(jié)合與攝�。┫碌募�(xì)胞結(jié)合與攝取情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在4°C下，cRGD修飾的LNP與細(xì)胞的結(jié)合能力顯著提高，且PCT和ILT法制備的LNP結(jié)合能力相似（圖3A-B）。在37°C下，cRGD修飾的LNP攝取量也顯著增加，且兩種方法制備的LNP攝取趨勢(shì)一致（圖3D-E）。這表明多肽修飾有效提高了LNP的細(xì)胞結(jié)合與攝取能力，但制備方法對(duì)結(jié)合與攝取過(guò)程的影響較小。

Fig. 3. Binding and uptake of ILT and PCT cRGD LNPs.

為了驗(yàn)證cRGD修飾的LNP是否通過(guò)特異性受體介導(dǎo)細(xì)胞攝取，研究進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在存在游離cRGD的情況下，cRGD修飾的LNP與細(xì)胞的結(jié)合和轉(zhuǎn)染效率均顯著降低（圖4A-D）。這表明cRGD修飾的LNP確實(shí)通過(guò)特異性受體介導(dǎo)細(xì)胞攝取，且PCT法制備的LNP在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中仍表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率。

Fig. 4. Binding and transfection of cRGD targeted LNPs is ligand specific.

體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞趨向性
研究評(píng)估了cRGD修飾的LNP在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未修飾的LNP相比，cRGD修飾的LNP在血液中的半衰期顯著縮短（從41.8分鐘縮短至10.5分鐘和12分鐘），表明靶向配體加速了LNP的清除（圖5B）。在器官生物分布方面，cRGD修飾的LNP在肺和脾臟中的積累顯著增加，而在心臟和腎臟中的積累減少（圖5C-D）。這表明cRGD修飾有效改變了LNP的體內(nèi)分布。

通過(guò)測(cè)量各器官中熒光素酶的表達(dá)量，研究發(fā)現(xiàn)cRGD修飾的LNP在肺和脾臟中的轉(zhuǎn)染效率顯著提高，而在肝臟中的表達(dá)降低（圖5E）。這與生物分布結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了cRGD修飾對(duì)LNP體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率的影響。值得注意的是，盡管PCT和ILT法制備的LNP在生物分布上相似，但PCT法制備的LNP在轉(zhuǎn)染效率上仍表現(xiàn)更優(yōu)。

Fig. 5. Comparison of pharmacokinetics and activity in healthy mice.

為了評(píng)估cRGD修飾的LNP在體內(nèi)的細(xì)胞趨向性，研究使用了Ai9小鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，cRGD修飾的LNP通過(guò)PCT法制備后，其轉(zhuǎn)染活性顯著偏向于多器官的內(nèi)皮細(xì)胞。在肺和心臟中，cRGD靶向LNP顯著提高了內(nèi)皮細(xì)胞中的報(bào)告基因表達(dá)（圖6A-E）。這表明cRGD修飾的LNP能夠有效靶向內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性遞送。

Fig. 6. Cell tropism of cRGD PCT LNPs.

02 小結(jié)
本研究首次比較了PCT和ILT兩種多肽修飾LNPs的制備方法，發(fā)現(xiàn)盡管兩種方法制備的LNPs在物理化學(xué)性質(zhì)上相似，但PCT法在體外轉(zhuǎn)染效率和體內(nèi)活性上均表現(xiàn)更優(yōu)。這可能是由于PCT法中多肽修飾發(fā)生在LNP制備之后，對(duì)LNP內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響較小，更有利于受體結(jié)合。此外，多肽修飾可能影響LNP的蛋白冠形成，進(jìn)而影響其體內(nèi)分布和細(xì)胞攝取。

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參考文獻(xiàn)：Katelyn Miyasaki, Sangwoo Han, Olivia Carton, Rebecca M. Kandell, Jonathan Gunn, Ester J. Kwon. Formulation methods for peptide-modified lipid nanoparticles. Journal of Controlled Release, 2025, 385: 114030. DOI: 10.1016/j.jconrel.2025.114030.