體外藥效評價之ADC藥物生物活性方法開發(fā)和驗證案例
文章來源公眾號：戴草帽的漁夫 作者：戴草帽的漁夫
SDE-100是靶點為CD25特異性抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）。白血病患者體內(nèi)的癌變白細胞表
高表達CD25。生物學活性選用了人非霍奇金大細胞淋巴瘤細胞Karpass 299細胞系，該細胞系細胞膜表面高表達CD25。
在進行細胞實驗之前，對細胞進行了4周時間的培養(yǎng)，監(jiān)測其生長速率，以確定細胞倍增時間。這個步驟非常關(guān)鍵，因為用于偶聯(lián)抗體的小分子毒素MMAE與微管蛋白的相互作用只有在細胞分裂或嘗試分裂時才會導致細胞死亡。
研究表明，Karpass 299細胞的倍增時間約為30小時，且需要大約三次倍增才能使活細胞和死細胞之間產(chǎn)生顯著差異，從而便于在檢測中識別。因此，該細胞的培養(yǎng)時間可為檢測方法開發(fā)的早期階段確定藥物與細胞的初始孵育時間提供參考。
在細胞培養(yǎng)初期，該團隊建立了兩級細胞庫，一個主細胞庫和兩個工作細胞庫。通過使用工作細胞庫，能夠確保所有實驗均使用同一代細胞，從而降低細胞間的變異性。
細胞生物活性測定
1.將Karpass 299細胞接種于96孔板中，使其分布均勻。藥物以濃度梯度的形式加入到96孔板中，高濃度位于孔板頂部，低濃度位于孔板底部，細胞與藥物共同孵育5天；
2.取出孵育5天的96孔板，加入MTS檢測試劑。MTS為一種四唑化合物，其檢測原理為黃色的MTS在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NA）存在下會被還原成藍紫色的甲臜，NADPH用于檢測活細胞，死細胞顯示黃色，活細胞孔則為藍色。在加入MTS孵育3小時后，觀測到孔板內(nèi)顏色從黃色逐漸變?yōu)樗{色（由上而下），顏色變化與藥物濃度呈正相關(guān)；
3.用酶標儀讀取OD490 nm吸收光，OD值高表示活細胞數(shù)量多，OD值低表示死細胞數(shù)量多。結(jié)果見圖1：
ADC SDE-100的方法開發(fā)
開發(fā)檢測方法時，首先需要研究抗體及其抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）的各種作用機制。
1）抗體與靶點結(jié)合可能產(chǎn)生細胞毒性作用，例如通過抑制生長因子受體的二聚化和激活
2）抗體的可結(jié)晶片段（FC）尾部也可能通過抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性吞噬作用（ADP）或補體依賴性細胞毒性（CDC）募集免疫系統(tǒng)的細胞毒性成分。
在抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）中，除了藥物介導的細胞毒性外，還可能誘導產(chǎn)生這些細胞毒性效應(yīng)。因此，可能需要開發(fā)一系列基于細胞的檢測方法，例如抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或細胞毒性（CDC）檢測，以測試ADC的各種作用機制，尤其是在單克隆抗體被證實具有治療作用的情況下，必須確定將該抗體與細胞毒素連接不會改變或消除其治療作用機制。
評估細胞內(nèi)MMAE激活導致細胞凋亡
評估特定抗體偶聯(lián)藥物（ADC）及其靶細胞類型的相關(guān)文獻，不僅是明確其多重作用機制的必要途徑，更為測定方法開發(fā)初期的起始條件設(shè)定提供了重要依據(jù)。
開發(fā)細胞檢測方法時，需要克服的一個重要挑戰(zhàn)是生物學變異。細胞系之間的變異來源包括細胞倍增時間、細胞表面抗原密度、毒素敏感性和接種密度。因此，在開發(fā)新的檢測方法時，優(yōu)化孵育時間、細胞暴露于藥物的時間、細胞密度以及藥物濃度范圍至關(guān)重要。明確定義最終效力曲線的特征也至關(guān)重要。表1列出了方法開發(fā)所需效價曲線的特征，主要表現(xiàn)為3個特征：
1）數(shù)據(jù)點本身必須定義一條曲線，該曲線具有四個參數(shù)，分別為上漸近線、下漸近線、線性部分以及易于定義的EC50至少應(yīng)有三個點；
2）上下漸近線之間的倍數(shù)響應(yīng)差異，應(yīng)該能夠用四參數(shù)邏輯模型擬合數(shù)據(jù)，且R平方值大于 0.95，表明原始數(shù)據(jù)與模型擬合良好；
3）為了確保樣品和參比物與細胞的相互作用方式相同，各自效價曲線的線性部分必須平行，這種平行性可通過目測和曲線的統(tǒng)計分析來驗證。影響這些特征的檢測參數(shù)主要有藥物濃度系列、藥物孵育時間和細胞接種密度。
表1 所需效價曲線的特征
圖2顯示在初始細胞密度和孵育時間固定的情況下，對細胞加入不同藥物濃度系列的試驗結(jié)果。該試驗證明了想要開發(fā)的檢測方法是可行的。此外，該實驗還確定了適用于后續(xù)開發(fā)步驟的合適藥物濃度系列。圖中曲線呈現(xiàn)出良好的 S 形，具有相當清晰的上漸近線、線性區(qū)域和下漸近線。
圖3顯示了不同孵育時間和細胞密度的影響。左圖和右圖分別是孵育5天和6天，不同細胞密度、相同藥物濃度的結(jié)果；與孵育5天相比，孵育6天后效力曲線的質(zhì)量有所下降。
原因可能是因為孵育6天有大量細胞死亡，導致難以在檢測中區(qū)分活細胞和死細胞。所以，確定孵育5天被認為是獲得高質(zhì)量效力曲線的最佳時間。
對孵育5天時間的曲線進行統(tǒng)計分析，以確定哪條曲線質(zhì)量最佳。接下來重點關(guān)注每條曲線的R平方值，以確定哪條曲線最能擬合相應(yīng)的數(shù)據(jù)。
對5天培養(yǎng)曲線的分析，紅色曲線展現(xiàn)出最佳的R²值，R²值最接近于1，且AD比值最高。在此基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化了濃度系列和細胞密度，最終生成了用于預(yù)驗證的最終檢測方法。
在報告結(jié)果時未對每個樣品進行絕對效價值報，而是每次測定中都會加入一個參考品，以相對效價作為報告結(jié)果。
圖4藍色為參考品、紫色為對照樣品，對照樣品與參考品曲線完全重合，根據(jù)曲線的偏倚情況可以看出左圖中低DAR值樣品與右圖的高DAR樣品相比，高DAR值樣品具有較高的活性值。
區(qū)分高DAR和低DAR樣品是ADC效力測定中的另一個重要指標，因為ADC的作用機制是內(nèi)化和隨后的毒素釋放，如果檢測方法對DAR不敏感，則ADC未能殺死細胞的機制以及該檢測方法是否適合作為體內(nèi)藥物活性的模型都會受到質(zhì)疑。
細胞活性分析方法驗證
方法驗證按照ICH指南進行，圖5顯示了該檢測方法的線性度和范圍結(jié)果，其線性度與標稱值之間存在統(tǒng)計學意義上的顯著相關(guān)性，相對效價均在50%～200%之間（相對值）。
表2為方法驗證的驗收標準，結(jié)果顯示所有數(shù)據(jù)點的準確度和精密度均在50%～200%之間，通過了驗收標準，判定該檢測方法的有效范圍為50%～200%。
評估的準確性是通過計算相對偏差來確定的，相對偏差是將特定評估的名義效力與觀察到的效力進行比較。
評估測定中最大的相對偏差百分比為3.3%。觀察到評估結(jié)果為141%，比預(yù)期高3.3%。
重復性是通過測量在同一次運行中進行的6次100%評估的相對標準偏差(RSD)來確定的，結(jié)果為3.9%；
中間精密度通過四次評估確定，每次評估分兩次進行，由不同的分析員使用不同批次的胎牛血清作為培養(yǎng)基，并在不同的日期進行。相對標準偏差（RSD）為4.5%；
通過比較使用兩個不同的細胞庫進行評估的相對偏差來確定穩(wěn)健性，最大相對偏差百分比為5.6%；
結(jié)果表明，考察評估準確性、一次運行內(nèi)的變異性、運行間的變異性以及不同細胞庫之間的變異性，所有結(jié)果均通過了方法驗證的驗收標準。
系統(tǒng)適用性標準，效價曲線的r平方值、每種藥物濃度下三個重復測量的精密度、AD 比率以及用于確定相對效價的樣品曲線和參考曲線的平行性。這些系統(tǒng)適用性標準符合驗證階段設(shè)定的驗收標準，并隨后被納入樣品測試的數(shù)據(jù)分析中。使用經(jīng)驗證的檢測方法生成的數(shù)據(jù)必須滿足這些系統(tǒng)適用性標準才能被接受。
圖6通過比較ADC SDE‑100的相對效力與單克隆抗體 HuMax‑TAC和NAC淬滅毒素連接子vcMMAE的相對效力，檢測了該方法的特異性。
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