利用全人源小鼠和Beacon單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)掘RSV強(qiáng)效中和抗體
近期，來自廣州實(shí)驗(yàn)室、廣州醫(yī)科大學(xué)和南開大學(xué)的研究人員在病原微生物學(xué)知名雜志PLOS Pathogens上發(fā)表研究論文：Discovery and molecular mechanism of potent neutralizing antibody from humanized mice with respiratory syncytial virus。
該研究借助和鉑醫(yī)藥Harbour H2L2全人源轉(zhuǎn)基因小鼠和Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)成功篩選出多個(gè)具有顯著中和活性的抗體。其中，抗體PR306007對(duì)RSV-A和B亞型均表現(xiàn)出顯著優(yōu)越的廣譜中和能力，在體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗RSV感染活性，并對(duì)上下呼吸道感染均顯示出良好防護(hù)效果。
01研究背景
呼吸道合胞病毒（RSV）是導(dǎo)致嬰幼兒、老年人及其他弱勢(shì)群體下呼吸道感染的主要病原體，對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成重大威脅。目前已有部分中和抗體（如帕利珠單抗、尼塞維單抗）用于預(yù)防，但仍存在頻繁給藥、高成本、免疫逃逸風(fēng)險(xiǎn)等問題。RSV預(yù)融合F蛋白（pre-F）是中和抗體的主要靶點(diǎn)，其構(gòu)象特異性表位（如 site Ø、V）能誘導(dǎo)更強(qiáng)免疫反應(yīng)。
02主要研究結(jié)果
1.利用Beacon®從免疫小鼠中篩選單克隆抗體
研究者以RSV pre-F蛋白為免疫原免疫H2L2全人源轉(zhuǎn)基因小鼠，再利用Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)從384個(gè)RSV F蛋白特異性單B細(xì)胞中回收獲得331對(duì)天然配對(duì)的抗體VH-VL序列�；谛蛄卸鄻有院椭泻突钚院Y選，最終鑒定出12個(gè)強(qiáng)效中和抗體（NT50＞1.6 log），其重鏈和輕鏈分別源自VH1/3/4和Vk1/2/3三大種系譜系，顯示出與人抗體庫高度相似的基因使用偏好。
圖1. 中和抗體發(fā)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程示意圖（A）及篩選得到的抗體配對(duì)序列（B）；中和抗體輕重鏈譜系（C, D）。
2.中和抗體鑒定
通過中和實(shí)驗(yàn)（CPE/FFA），從12株單抗中篩選出最強(qiáng)中和活性的PR306007，且對(duì)RSV-A, B亞型均表現(xiàn)出顯著優(yōu)越的廣譜中和能力。
圖2. 6株單抗顯示出抗病毒活性，且單抗PR306007的效果優(yōu)于陽性對(duì)照帕利珠單抗和14N4（A, B）。PR306007對(duì)RSV-B亞型顯示出中和活性（C, D）。ELISA和SPR實(shí)驗(yàn)顯示PR306007偏好結(jié)合RSV pre-F（E-J）。
3.中和抗體的結(jié)構(gòu)解析
通過冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，揭示其結(jié)合表位橫跨抗原位點(diǎn)II和V，結(jié)合模式新穎 。PR306007的表位在RSV A/B亞型中高度保守，S173L突變不影響氫鍵形成，即潛在抗逃逸能力強(qiáng)。其重鏈基因源自IGHV1–8，在已知抗病毒抗體譜系中較為罕見。
圖3. PR306007中和抗體與RSV預(yù)融合蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。
圖4. PR306007與已報(bào)道的RSV抗體的對(duì)比。
4.體內(nèi)預(yù)防效果顯著
在RSV感染的BALB/c小鼠模型中，PR306007在0.625和2.5 mg/kg劑量下均能有效抑制病毒在鼻腔和肺部的復(fù)制，效果與帕利珠單抗相當(dāng)；肺組織病理學(xué)分析顯示PR306007預(yù)處理可維持肺泡結(jié)構(gòu)完整性，顯著減少炎癥細(xì)胞浸潤，證實(shí)其具有與帕利珠單抗相似的預(yù)防性保護(hù)功效。
圖5. PR306007在RSV感染小鼠模型中的預(yù)防效果評(píng)估，包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、體重監(jiān)測(cè)、鼻腔和肺部病毒載量檢測(cè)以及肺組織病理學(xué)分析。
03小結(jié)
本研究聯(lián)合使用了全人源轉(zhuǎn)基因小鼠和Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)，該方法不依賴于康復(fù)期病人或接種疫苗的人群，也不需要對(duì)鼠源抗體進(jìn)行人源化改造，對(duì)分泌抗體的漿細(xì)胞直接進(jìn)行高效篩選。其中，發(fā)現(xiàn)的單抗PR306007在體內(nèi)表現(xiàn)出強(qiáng)力的預(yù)防效果，凸顯其作為抗RSV療法的潛力。這種聯(lián)合使用全人源轉(zhuǎn)基因小鼠和基于Beacon®的高效單B抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)，為疫苗或中和抗體的快速高效開發(fā)提供了策略。
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