新型組織透明化技術助力保存小鼠組織結構
骨髓作為生物體內負責造血的核心場所，其內部復雜的細胞與血管網(wǎng)絡在生理穩(wěn)態(tài)、免疫應答以及組織修復過程中扮演著關鍵角色。然而，由于骨髓組織深藏于堅硬的骨皮質內部，且其結構極為脆弱，傳統(tǒng)成像技術難以在不破壞樣本結構的前提下，實現(xiàn)對完整長骨（如小鼠股骨）骨髓腔深處進行高分辨率三維觀測。這一技術瓶頸限制了對骨髓微環(huán)境，特別是細胞間相互作用和空間分布關系的深入理解。為此，研究團隊開發(fā)了一種名為MarShie（骨髓屏蔽）的新型組織透明化技術。該技術通過引入SHIELD環(huán)氧化物固定、EDTA溫和脫鈣、主動脫脂以及Quadrol基團的漂白步驟，成功實現(xiàn)了對完整小鼠股骨骨髓結構的完美保存與高度透明化，為在單細胞乃至亞細胞水平上對骨髓進行三維定量分析鋪平了道路。
本研究的重要發(fā)現(xiàn)由Till Fabian Mertens, Alina Tabea Liebheit, Johanna Ehl, Ralf Kohler, Asylkhan Rakhymzhan, Andrew Woehler, Lukas Katthan, Gernot Ebel, Wjatscheslaw Liublin, Ana Kasapi, Antigoni Triantafyllopoulou, Tim Julius Schulz, Raluca Aura Niesner與Anja Erika Hauser等研究人員共同完成。研究成果以題為“MarShie: a clearing protocol for 3D analysis of single cells throughout the bone marrow at subcellular resolution”的論文形式在《Nature Communications》期刊上發(fā)表。
重要發(fā)現(xiàn)
01論文的核心貢獻與實驗結論
本論文最核心的貢獻是開發(fā)并驗證了MarShie這一針對骨髓組織優(yōu)化的整體透明化技術流程。該技術成功解決了骨髓成像中的兩大核心難題：組織結構的完整保存與深部組織的光學透明。通過結合薄層光顯微技術（LSFM），研究團隊首次實現(xiàn)了在完整小鼠股骨中，對從骨內膜到骨髓腔最深處所有區(qū)域的細胞進行三維成像，分辨率達到了單細胞乃至亞細胞級別。
實驗過程始于對小鼠股骨樣本的精心處理。MarShie協(xié)議的核心步驟包括：采用SHIELD環(huán)氧化物進行灌注固定，以構建穩(wěn)定的組織支架；使用EDTA進行溫和脫鈣，去除骨骼的無機成分；通過電動力學方法促進骨髓的均勻脫脂；最后利用Quadrol進行高效脫色。這一系列操作確保了骨髓結構在透明化過程中不發(fā)生腫脹或收縮，完整保留了細胞間的空間關系。研究證實，經(jīng)過MarShie處理后的股骨，在785納米波長下光學透射率超過90%，為深部成像提供了必要條件。
03多色熒光成像與信號增強
在成像能力方面，研究團隊驗證了MarShie技術與多種熒光信號的兼容性。他們使用了CX3CR1-GFP x Cdh5-tdTomato/histone-GFP等多種報告基因小鼠模型，成功檢測了內源性GFP、tdTomato等熒光蛋白信號。針對GFP信號在深部骨髓中較弱的問題，他們引入了基于納米抗體的信號增強技術（anti-GFP-Atto647N nanobooster），將信號波長轉移至遠紅光范圍，顯著提升了信噪比（SNR）。在深部骨髓區(qū)域，Atto-647N信號的信噪比高達20.3，遠優(yōu)于未增強的GFP信號（SNR=4.0），這使得即使像細胞樹突狀突起這樣的精細結構也能被清晰分辨。
04圖像預處理與人工智能分割
針對薄層光顯微鏡成像中因骨骼散射和吸收產(chǎn)生的條紋偽影，研究團隊開發(fā)了一種定向快速傅里葉變換（FFT）去條紋算法。該算法根據(jù)顯微鏡照明光路的方向性，在傅里葉空間構建特異性濾波器，能夠有效抑制條紋偽影，同時保留樣本的結構細節(jié)和空間分辨率（經(jīng)測量，去條紋前后線剖面分辨率均為約2.1微米）。經(jīng)過預處理的圖像質量足以支持后續(xù)的機器學習分析。
利用LABKIT軟件中的隨機森林分類器，研究團隊對血管網(wǎng)絡（Cdh5-tdTomato信號）和特定細胞類型（如CX3CR1+髓系細胞）進行了精確的三維分割與量化。通過計算分割結果與人工標注之間的交并比（IoU），驗證了該自動分割算法的可靠性（IoU值約為0.65-0.68），與專業(yè)人員標注的一致性相當。這一技術流程使得對骨髓內細胞密度、空間分布及其與血管距離的定量分析成為可能。
創(chuàng)新與亮點
01突破的成像難題
MarShie技術突破了過去骨髓三維成像的多個關鍵瓶頸。首先，它解決了脆弱骨髓組織在透明化過程中結構塌陷或變形的難題，首次實現(xiàn)了在完整長骨中對骨髓腔全范圍結構的無損保存。其次，它克服了骨髓深部區(qū)域由于血紅蛋白等色素造成的光吸收和散射問題，通過優(yōu)化的脫色步驟，使光能夠穿透至骨髓腔中心區(qū)域。最后，它通過創(chuàng)新的圖像預處理和機器學習方法，解決了在復雜背景下對單個細胞進行自動、精確識別和分割的挑戰(zhàn)。
在技術層面，MarShie的亮點在于其高度的集成性和通用性。它不僅兼容內源性熒光蛋白報告基因，還支持通過靜脈注射抗體進行體內細胞標記（如CD31、CD169），并允許利用二次諧波成像（SHG）對膠原等結構進行無標記觀察。這種“多模態(tài)”成像能力降低了對特殊轉基因小鼠模型的依賴，拓寬了技術的應用范圍。此外，經(jīng)過MarShie處理的樣本其熒光信號可穩(wěn)定保存長達六個月，為樣本的長期保存和重復測量提供了便利。
03光學生物醫(yī)療價值
從生物醫(yī)學價值來看，MarShie技術為我們打開了一扇窺探骨髓“黑箱”內部微觀世界的高清窗口。研究團隊利用該技術取得了重要的生物學發(fā)現(xiàn)：例如，清晰地揭示了衰老小鼠骨髓中中央靜脈竇體積的顯著萎縮以及皮質骨內出現(xiàn)異位骨髓島的年齡相關性變化。在骨骼損傷模型中，該技術能夠動態(tài)、三維地展示損傷后髓系細胞的聚集、血管新生以及細胞與血管相互作用的時空過程。這對于研究造血干細胞niche、免疫細胞動力學、骨相關疾�。ㄈ绻琴|疏松、骨髓瘤）的病理機制以及組織再生醫(yī)學都具有不可估量的價值，有望推動骨髓生物學研究進入一個全新的定量化、空間化時代。
總結與展望
綜上所述，MarShie技術通過其卓越的組織保存能力、深部透明化效果和高分辨率成像兼容性，成功建立了一套用于完整長骨骨髓三維分析的標準化流程。該項工作不僅是技術上的創(chuàng)新，更通過具體的生物學應用實例，如揭示年齡相關的血管結構變化和損傷修復過程中的細胞動態(tài)，證明了其強大的實用價值。該技術將光學工程、圖像信息學與骨髓生物學緊密結合，為在單細胞水平上無偏地、定量地研究完整器官級的細胞生態(tài)系統(tǒng)提供了強大工具。展望未來，MarShie技術框架有望被廣泛應用于人類骨骼樣本分析、其他硬組織研究以及更廣泛的生物醫(yī)學領域，從而深化我們對骨髓在健康與疾病狀態(tài)下功能的理解，并為開發(fā)新的治療策略提供前所未有的空間洞察力。
聲明：本文僅用作學術目的。
Mertens TF, Liebheit AT, Ehl J, Köhler R, Rakhymzhan A, Woehler A, Katthän L, Ebel G, Liublin W, Kasapi A, Triantafyllopoulou A, Schulz TJ, Niesner RA, Hauser AE. MarShie: a clearing protocol for 3D analysis of single cells throughout the bone marrow at subcellular resolution. Nat Commun. 2024 Feb 26;15(1):1764.
DOI:10.1038/s41467-024-45827-6.
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