NK細胞是先天免疫系統(tǒng)的關鍵細胞毒性淋巴細胞，在抗腫瘤和抗病毒感染中發(fā)揮核心作用。它起源于骨髓中的造血干細胞（HSC），其發(fā)育過程主要發(fā)生在骨髓中，部分發(fā)生在次級淋巴組織以及一些外周組織中，發(fā)育過程由一系列轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子共同驅(qū)動和調(diào)控_[1]。

NK細胞發(fā)育圖譜_[2]

NK細胞分選是相關研究中的關鍵環(huán)節(jié)，在磁珠分選實驗中有很多不可忽視的關鍵點，直接影響著分選實驗的得率和純度。本文將詳細解析美天旎磁珠分選實驗前后的關鍵注意事項，并深入解讀三款熱門NK細胞磁珠分選實驗流程（CD56、NK cell），涉及陽性分選，陰性分選策略。助您一站式掌握NK細胞磁珠分選核心技術！

關于磁珠分選實驗，您務必要知道的關鍵點（耐心看完，后附分選實操案例）

分選前準備
❖ 確認磁珠：根據(jù)您的實驗種屬、樣本來源、目的細胞marker選擇適配的磁珠。
❖ 確認分選策略： 根據(jù)您實驗的指標類型以及后續(xù)需求選擇對應的分選策略。

陽性分選
目的細胞被磁性標記后，作為陽性標記組分直接分選出來。該方法常用于以下情況：
1. 分選表達單一表面標志物的細胞分選（如CD3+,CD4+,CD8+細胞）
2. 稀有細胞的分選 (如循環(huán)腫瘤細胞CTC、腫瘤浸潤淋巴細胞TIL)
3. 表達較弱的表面標志物細胞分選（如CD133+細胞）
4. 去除特定細胞群分選（如TCRαβ+T去除、CD45RA+細胞去除）

陰性分選/去除分選
非目的細胞磁性標記后從細胞混合物中去除，即未磁性標記的細胞為目的細胞。該方法常用于以下情況：
1. 去除特定非目的細胞群
2. 缺乏目的細胞特異性表面標志物的分選（如某些腫瘤細胞、神經(jīng)元）
3. 磁珠分選后需進一步通過陽性選擇分選細胞亞群（CD4+CD25+Treg）
4. 分選后的細胞表面不可帶有任何磁珠標記

順序分選
聯(lián)合使用兩種分選策略，例如先陰選后陽選，或先使用可剪切的REAlease磁珠后進行陽性分選。該方法常用于以下情況：
1. 同步分離兩種特定細胞亞群：首先通過陰性分選去除共同雜質(zhì)細胞，隨后利用陽性分選將剩余的目標細胞亞群分開
2. 目標抗原在非目的細胞上存在交叉表達，導致直接陽性分選純度不足
3. 要分選極稀有的細胞，通過預富集步驟提高目的細胞的純度和得率

全血分選
從血液樣本中直接分選目的細胞，無需裂解紅細胞，無需密度梯度離心。該方法常用于以下情況：
1. 簡化實驗流程，省去離心等操作步驟，短時間內(nèi)獲得高回收率，高活性的目的細胞
2. 針對血樣樣本量較少，可最大程度上節(jié)省樣本的損失

❖ 確認分選柱：對于不同類型的分選柱選擇，關鍵是不要超過推薦的細胞量，否則會使柱子過載，導致分選效果不佳�？筛鶕�(jù)您的細胞總數(shù)和目標細胞數(shù)、分選策略選擇對應的分選柱，可參考下圖。對于具體使用的磁珠，參考每個磁珠說明書附的數(shù)據(jù)表，進行分選柱的選擇。

注：全血分選磁珠需搭配全血分選柱套裝（# 130-093-545），其中包含全血分選柱和全血分選緩沖液。

相關產(chǎn)品貨號：

相關產(chǎn)品貨號：

❖ 確認分選平臺：根據(jù)您的分選柱，選擇適配的分選平臺。

相關產(chǎn)品貨號：

注：全血分選柱可搭配Midi MACS分選器（#130-042-302）或 QuadroMACS  Separator分選器 (# 130-090-976)

❖ 準備分選緩沖液：
方案1：將MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）按照1:20配置，作為分選buffer；分選緩沖液需放置4°預冷。

方案2：如您的細胞對于疊氮化鈉成分不敏感，可直接選擇autoMACS Running Buffer（#130-091-221）進行分選。該buffer內(nèi)含有少量的疊氮化鈉，對某些敏感細胞，例如神經(jīng)細胞造成影響。

方案3：含0.5%BSA(abs9156-50g)、2mM EDTA(abs9133)的PBS(abs962)，配置后調(diào)整PH至7.2，需去除氣泡，氣泡可能導致分選柱堵塞。配好的buffer可先靜置，也可使用真空抽濾、超聲消除氣泡。

❖ 細胞計數(shù)和活性檢測：
分選前需要檢測單細胞樣本的細胞量及細胞活率，通過細胞量計算您的磁珠添加量；建議起始單細胞活率達到85%以上再進行磁珠分選，會得到較為理想的實驗結(jié)果。

您可以選擇對應產(chǎn)品提升樣本的初始活性：

細胞篩網(wǎng)：利用細胞篩網(wǎng)將粗提的單細胞懸液過篩，過濾組織團塊，可根據(jù)您的細胞大小選擇合適孔徑的篩網(wǎng)（MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462或70um細胞篩網(wǎng)#abs7232）

碎片去除試劑：利用密度梯度離心的原理去除碎片（Debris Removal Solution#130-109-398或細胞分離液#abs9102 ）、

死細胞去除磁珠：磁珠標記死細胞表面的磷脂酰絲氨酸，通過高強度磁場，將死細胞去除（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）、

裂紅試劑：利用細胞內(nèi)外存在鹽離子濃度差而導致細胞膜脹破的原理來裂解無核紅細胞。（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183或紅細胞裂解液（1×）#abs9101）

分選過程中：

一、磁珠篇：
❖ 美天旎磁珠為膠體溶液，不會沉淀，實驗前不用搖晃即可直接使用。
❖ 磁珠說明書中推薦的磁珠標記的體積適用于1×10⁷的細胞。當您的總細胞量少于10⁷細胞，需按照說明使用相同的體積。當超過10⁷細胞數(shù)，將所有試劑體積和總體積按照相應比例增加。
❖ 磁珠孵育溫度根據(jù)說明書通常為2-8℃，建議在冰箱中避光孵育，直接放置于冰上會使磁珠結(jié)合效率變差。提高溫度或延長孵育時間均可能導致非特異性磁性標記。如磁珠說明書中推薦孵育時間為（+19-25℃），則磁珠應在室溫條件下避光孵育。

二、分選篇：
❖ 分選柱在加樣前需使用緩沖液潤洗，潤洗分選柱的緩沖液請事先回溫至操作環(huán)境溫度，防止預冷的緩沖液潤洗室溫分選柱，導致分選柱中形成小氣泡，使分選效果不佳。
❖ 整個分選過程要盡量快速操作，保持細胞處于低溫，分選過程中使用的分選緩沖液需預冷，可防止抗體包裹在細胞表面以及非特異性的磁性標記。
❖ 每一次向分選柱中加液均需等到分選柱中的液體流空，最后一滴在分選柱中不滴出時，再進行下一步加液。
❖ 收集分選柱中磁珠標記的細胞液，需要將分選柱從磁場中拿下，放至收集管上，向分選柱加入緩沖液后立即進行栓塞按壓；分選柱栓塞只能按壓一次，請勿反復操作。
❖ 分選柱為一次性耗材，請勿重復使用。

分選結(jié)束后：
❖ 利用流式檢測目的細胞占比及分選后細胞活性，計算出分選純度和分選得率，您可參考以下公式進行計算：
· 分選純度=分選后目的細胞總數(shù)量/分選后所得所有細胞總數(shù)量
· 分選得率=分選后目的細胞總數(shù)量/分選前目的細胞總數(shù)量
注意：分選前目的細胞總數(shù)量=標記后未上柱子前的細胞懸液*目的細胞占比

為您詳細解讀3款熱門NK細胞分選實例，干貨來襲，照搬流程直接做實驗！
● 陽性分選
130-050-401 CD56 MicroBeads, human（對應凍干磁珠可選130-097-042）

● 陰性分選
130-092-657 NK CellI Isolation Kit, human ;
130-115-818 NK CellI Isolation Kit, mouse

陽性分選:CD56 MicroBeads, human（#130-050-401）

磁性分選耗材
❖ MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖ MS分選柱對應的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖ LS分選柱對應的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖ MACS MultiStand（#130-042-303）
❖ MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-Separation Filters 30μm預分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標記前去除細胞團，防止堵塞分選柱）
❖ 如需進行去除分選，需選擇LD分選柱（130-042-901），搭配Midi MACS分選器

實驗步驟
一、磁珠標記CD56細胞
1.細胞計數(shù)；
2.細胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.細胞重懸，每1×10⁷細胞添加80μL分選緩沖液；
4.每1×10⁷細胞添加20 μLCD56 MicroBeads磁珠；
5.混勻，于2-8℃孵育15min；
6.每1×10⁷個細胞加入1-2 mL分選緩沖液洗滌細胞，300×g離心10分鐘，棄上清 
7.添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細胞，對于更多的細胞數(shù)量，需要相應提高緩沖液體積）

二、磁珠分選CD56細胞
1.將分選柱放入對應的MACS分選器的磁場中，如需詳細分選柱信息請查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2.用適量緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進行下一步驟（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤洗）；
3.將制備好的細胞懸液加入分選柱中，收集的流穿細胞液為未被標記的細胞；
4.分別用分選緩沖液清洗柱子三次（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液清洗3次；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液清洗3次），收集未被標記的非CD56細胞；
5.從分選器中取出分選柱，將其放到合適的收集管上；
6.吸取適量的緩沖液（MS：1 mL；LS：5 mL），加到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標記的細胞，即為CD56細胞；

用LD（130-042-901）分選柱去除分選
1.將LD分選柱放入MidiMACS分選器的磁場中；
2.用2 mL緩沖液濕潤分選柱；
3.將制備好的細胞懸液加到分選柱中；
4.收集流出來的細胞，再用1 mL緩沖液沖洗分選柱兩次，收集流出來的液體即為未被磁珠標記的CD56-細胞。

NK細胞分選: NK Cell Isolation Kit, human（#130-092-657）

磁性分選耗材
❖ MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖ MS分選柱對應的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖ LS分選柱對應的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖ MACS MultiStand（#130-042-303）
❖ MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-Separation Filters 30μm預分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標記前去除細胞團，防止堵塞分選柱）

實驗步驟
一、磁珠標記非NK細胞
1.細胞計數(shù)；
2.細胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.細胞重懸，每1×10⁷細胞添加40μL分選緩沖液；
4.每1×10⁷細胞添加10 μL NK Cell Biotin-Antibody Cocktail抗體；
5.混勻，于2-8℃孵育5min；
6.每1×10⁷細胞添加30 μL分選緩沖液；
7.每1×10⁷細胞添加20 μLNK Cell MicroBeads磁珠；
8.混勻，于2-8℃孵育10min；
9.添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細胞，對于更多的細胞數(shù)量，需要相應提高緩沖液體積）

二、磁珠去除非NK細胞
1.將對應分選柱放入分選器的磁場中，如需詳細分選柱信息請查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2.用適量緩沖液潤洗分選柱（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤洗）；
3.將制備好的細胞懸液加入到分選柱中，收集流出液，其中包含未標記的細胞，即富集的 NK細胞；
4.用適量的緩沖液沖洗柱子（MS分選柱每次使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱每次使用3mL分選緩沖液潤洗）。收集流過的未標記細胞，并與第3步中的流出液合并，最后收集的流出液為NK細胞。
5.(可選）如需非NK細胞，可將分離器上的分選柱移除，并將其放置在合適的收集管中。向分選柱中加入適量的分選緩沖液（MS分選柱使用1mL分選緩沖液，LS分選柱使用5mL分選緩沖液）。立即通過將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁性標記的非NK細胞保存?zhèn)溆谩?/span>

NK細胞分選: NK Cell Isolation Kit, Mouse（#130-115-818）

磁性分選耗材
❖ MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖ MS分選柱對應的Mini MACS分選器（#130-042-102）或OctoMACS分選器（#130-042-109）；
❖ LS分選柱對應的Midi MACS分選器（#130-042-302）或QuadroMACS分選器（#130-090-976）；
❖ MACS MultiStand（#130-042-303）
❖ MACS BSA Stock Solution（#130-091-376）和autoMACS Rinsing Solution（#130-091-222）1:20配置
❖ Pre-Separation Filters 30μm預分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標記前去除細胞團，防止堵塞分選柱）

實驗步驟
一、磁珠標記非NK細胞
1.細胞計數(shù)；
2.細胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.細胞重懸，每1×10⁷細胞添加40μL分選緩沖液；
4. 每1×10⁷細胞添加10 μL NK Cell Biotin-Antibody Cocktail抗體；
5.混勻，于2-8℃孵育5min；
6.每1×10⁷細胞添加2 mL分選緩沖液清洗細胞，300×g離心10分鐘，棄上清；
7.每1×10⁷細胞添加80 μL分選緩沖液；
8.每1×10⁷細胞添加20 μLAnti-Biotin MicroBeads磁珠；
9. 混勻，于2-8℃孵育10min；
10.（可選）加入熒光染色抗體（如 10μL CD49b-PE），在 2-8°C 避光孵育 5 min，用于后續(xù)流式分析。
11.添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細胞，對于更多的細胞數(shù)量，需要相應提高緩沖液體積）

二、磁珠去除非NK細胞
1.  將對應分選柱放入分選器的磁場中，如需詳細分選柱信息請查看MACS分選柱載量數(shù)據(jù)表；
2.  用適量緩沖液潤洗分選柱（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤洗）；
3.  將制備好的細胞懸液加入到分選柱中，收集流出液，其中包含未標記的細胞，即富集的 NK細胞；
4.  用適量的緩沖液沖洗柱子（MS分選柱每次使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱每次使用3mL分選緩沖液潤洗）。收集流過的未標記細胞，并與第3步中的流出液合并，最后收集的流出液為NK細胞。
5.  (可選）如需非NK細胞，可將分離器上的分選柱移除，并將其放置在合適的收集管中。向分選柱中加入適量的分選緩沖液（MS分選柱使用1mL分選緩沖液，LS分選柱使用5mL分選緩沖液）。立即通過將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁性標記的非NK細胞保存?zhèn)溆谩?/span>

以上就是三款熱門NK細胞磁珠分選的實驗流程！想了解更多NK細胞磁珠產(chǎn)品，小優(yōu)為您總結(jié)了NK細胞分選磁珠產(chǎn)品合集：

Human NK細胞分選：
貨號130-050-401 CD56 MicroBeads 
貨號130-092-657 NK Cell lsolation Kit 
貨號130-097-042 CD56 MicroBeads-lyophilized
貨號130-117-033 REAlease CD56 MicroBead Kit
貨號130-092-073 CD57 MicroBeads
貨號130-092-660 CD56+CD16+ NK Cell lsolation Kit
貨號130-092-661 CD56+CD16- NK Cell lsolation Kit
貨號130-092-659 CD56+CD8+/CD8- NK Cell lsolation Kit
貨號130-093-064 CD3+CD56+ NKT Cell lsolation Kit
貨號130-094-842 Anti-iNKT MicroBeads
貨號130-090-875 StraightFrom Whole Blood CD56 MicroBeads
貨號130-114-963 StraightFrom Buffy Coat CD56 MicroBead Kit
貨號130-117-024 StraightFrom LRSC CD56 MicroBead Kit
貨號130-128-759 StraightFrom Leukopak REAlease CD56 MicroBead Kit
貨號130-127-695 MACSxpress whole Blood NK Cell lsolation Kit
貨號130-127-696 MACSxpress Buffy Coat NK Cell lsolation Kit
貨號130-127-697 MACSxpress LRSC NK Cell lsolation Kit

Mouse NK細胞分選：
貨號 130-115-818 NK Cell lsolation Kit
貨號 130-052-501 CD49b (DX5) MicroBeads
貨號 130-095-390 Anti-NKp46 MicroBead Kit
貨號 130-096-513 NK1.1+ iNKT Cell lsolation Kit

參考文獻：
[1] Wang D, Malarkannan S. Transcriptional Regulation of Natural Killer Cell Development and Functions. Cancers. 2020;12(6):1591. doi:https://doi.org/10.3390/cancers12061591
[2]Schorr C, Krishnan MS, Capitano M. Deficits in our understanding of natural killer cell development in mouse and human. Curr Opin Hematol. 2023;30(4):106-116. doi:10.1097/MOH.0000000000000765