癌細(xì)胞逃避細(xì)胞死亡是癌癥發(fā)展的核心機(jī)制之一。正常情況下，細(xì)胞在完成其生命周期后，會(huì)通過凋亡這一程序性死亡方式，安靜地退出歷史舞臺(tái)。然而，癌細(xì)胞卻能夠通過各種手段逃避凋亡，從而無限增殖，形成腫瘤。因此，深入研究癌細(xì)胞逃避死亡的機(jī)制，對于揭示癌癥的本質(zhì)、開發(fā)有效的癌癥治療方法具有重要意義。

方法推薦：多模式自動(dòng)化高通量研究方法

基于細(xì)胞成像的研究平臺(tái)為探索細(xì)胞死亡過程和研究細(xì)胞的不同死亡機(jī)制提供了一種連續(xù)、實(shí)時(shí)和高通量的方法。

在這篇應(yīng)用指南中在這篇應(yīng)用指南中，我們使用 Cytation 聯(lián)合BioSpa 的多板位活細(xì)胞分析組合，通過將長時(shí)間無標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光成像技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，在 384 孔板中監(jiān)測并量化多種抗腫瘤藥物處理后 HT-1080 纖維肉瘤細(xì)胞系在 72 小時(shí)內(nèi)的增殖和死亡情況。

Cytation對接BioSpa 組成多板位自動(dòng)化活細(xì)胞工作站

樣本制備
HT-1080 細(xì)胞在含有 10 % FBS、2 mM 谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素抗生素的 Advanced DMEM 培養(yǎng)基中， 37 °C 、5 % CO2 培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 80 % 密度時(shí)，定期傳代。收集 HT-1080 細(xì)胞并懸浮后，以每個(gè)孔 500 個(gè)細(xì)胞的密度接種于 384 孔板中。細(xì)胞貼壁后（約 4 小時(shí)），將培養(yǎng)基更換為 Fluorobrite DMEM 培養(yǎng)基。將 Kinetic Apoptosis Kit 試劑添加到每個(gè)孔中，使最終濃度為 1 μL/mL pSIVA-IANBD 和 2 μL/mL PI。在微孔板上加入 4 種抗腫瘤藥物稀釋液，并在加藥后立即開始成像分析。

自動(dòng)化長時(shí)間活細(xì)胞成像程序設(shè)置
為實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)長時(shí)間成像，將細(xì)胞培養(yǎng)在與 Cytation 聯(lián)用的 BioSpa 8 中，在整個(gè) 72 小時(shí)的實(shí)驗(yàn)期間， BioSpa 8 在 37 °C、5% CO2 和濕度 80%–90% 的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，并通過 BioSpa 軟件對環(huán)境參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測和實(shí)時(shí)報(bào)告。每隔 2 小時(shí)，384 孔板自動(dòng)從 BioSpa 培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到 Cytation 5進(jìn)行細(xì)胞成像，在整個(gè)成像過程中，Cytation 5 內(nèi)置的環(huán)境控制功能使成像環(huán)境與 BioSpa 保持一致，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件。Cytation 5 所使用的寬視野相機(jī)僅需一張圖片即可采集整個(gè)樣本孔的圖像，最大程度地減少圖像采集時(shí)間。

72 小時(shí)無人值守的細(xì)胞增殖與凋亡實(shí)驗(yàn)開始了，明場成像和熒光成像輪番進(jìn)行，由智能化 Gen 5 軟件執(zhí)行圖像采集和所有的數(shù)據(jù)分析，包括曲線擬合與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

數(shù)據(jù)表現(xiàn)與解讀
本文研究了四種抗腫瘤藥物（十字孢堿、諾考達(dá)唑、喜樹堿和尼日利亞菌素）對細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四種抗腫瘤藥物對癌細(xì)胞的增殖和死亡產(chǎn)生了顯著影響。通過 Gen5 軟件生成的細(xì)胞計(jì)數(shù)曲線，研究者們可以直觀地看到整個(gè) 384 孔板中癌細(xì)胞的增殖速率。

圖1. 384 孔板細(xì)胞增殖曲線。紅色曲線展示了在為期三天的實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢。隨著藥物濃度從 C 行逐漸增加至 P 行，所有藥物均導(dǎo)致孔板中細(xì)胞增殖水平下降。

圖2. HT-1080 纖維肉瘤細(xì)胞增殖的劑量依賴性抑制。將幾種濃度的 (A) 諾考達(dá)唑（橙色圓，n = 12 個(gè)重復(fù)測定孔）和 (B) 喜樹堿（綠色圓，n = 12 個(gè)重復(fù)測定孔）在三天內(nèi)的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)圖疊加。Agilent BioTek Gen5 軟件生成 (C) 諾考達(dá)唑（橙色圓）和 (D) 喜樹堿（綠色圓）在 24 小時(shí)的單一時(shí)間點(diǎn)無標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)的劑量-響應(yīng)曲線。4 參數(shù)擬合用黑色實(shí)線表示， IC50 值用虛線表示。諾考達(dá)唑的 IC50 對應(yīng)于 48 nM，喜樹堿對應(yīng)于 12 nM。

此外，我們還利用熒光報(bào)告基因?qū)Φ蛲龊蛪乃罊C(jī)制進(jìn)行了深入研究。在拍攝明場圖像的同時(shí)，拍攝細(xì)胞凋亡標(biāo)志物 pSIVA 和壞死標(biāo)志物 PI 的相應(yīng)熒光圖像（圖 3A）。識(shí)別 pSIVA 和 PI 信號(hào)陽性的細(xì)胞（圖 3B），并用一級(jí) Mask 識(shí)別每個(gè)孔和時(shí)間點(diǎn)的單個(gè)細(xì)胞。

圖 3. 細(xì)胞凋亡和壞死陽性細(xì)胞的捕獲和識(shí)別。(A) 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn) pSIVA 凋亡標(biāo)志物（綠色，上圖）和 PI 壞死標(biāo)志物（紅色，下圖）陽性細(xì)胞的示例圖像。 (B) 通過細(xì)胞大小和信號(hào)閾值參數(shù)識(shí)別陽性凋亡和壞死細(xì)胞，并通過一級(jí) Mask 識(shí)別陽性細(xì)胞。

值得注意的是，在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)了一種有趣的現(xiàn)象：在某些藥物濃度下，盡管許多細(xì)胞正在經(jīng)歷凋亡或壞死，但總細(xì)胞數(shù)仍然在增加。這可能是由于癌細(xì)胞的快速增殖能力導(dǎo)致的。為了準(zhǔn)確評估藥物對癌細(xì)胞死亡的影響，我們將熒光信號(hào)（代表凋亡或壞死的細(xì)胞數(shù)）與無標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行了歸一化處理。這種歸一化方法消除了由于增殖速率差異引起的偏差，使得 EC50 值的確定更加準(zhǔn)確。

圖 4. 抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)響應(yīng)。(A) 諾考達(dá)唑在四種濃度下的細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)。由于總細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，中間濃度下凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)繼續(xù)上升。通過絕對細(xì)胞計(jì)數(shù)生成劑量-響應(yīng)曲線，并擬合至指定的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。由于細(xì)胞增殖，EC50 值隨時(shí)間顯著左移（EC50 24 小時(shí) = 106 nM，EC50 48 小時(shí) = 30 nM，EC50 68 小時(shí) = 17 nM）。(B) 與圖 A 中凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)相同，但以總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化（以百分比表示）。數(shù)據(jù)歸一化后，所有劑量-響應(yīng)曲線的 EC50 值均為約 100 nM。在 A 和 B 下圖中，Agilent BioTek Gen5軟件的 4 參數(shù)擬合線以實(shí)線顯示，EC50 插值線以虛線顯示。

圖 5. 抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死信號(hào)響應(yīng)。(A) 諾考達(dá)唑在四種濃度下的細(xì)胞壞死計(jì)數(shù)，（B）數(shù)據(jù)歸一化之后的計(jì)數(shù)結(jié)果。

為了比較和定量藥效，對所有藥物在 24 小時(shí)的歸一化壞死和凋亡信號(hào)進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析和曲線擬合（圖 24）。有趣的是，盡管尼日利亞菌素具有抑制增殖的功效（IC50 = 100nM，圖 20C），但即使在使用的最高濃度下，它也很少導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，并且細(xì)胞凋亡和壞死的 EC50 值尚未確定。

圖 6. 細(xì)胞凋亡和壞死的 EC50 測定。繪制每種藥物的壞死細(xì)胞百分比（左圖）和凋亡細(xì)胞百分比的劑量-響應(yīng)曲線。Agilent BioTek Gen5軟件進(jìn)行 4 參數(shù)擬合（實(shí)心彩色線）以及插值 EC50 值（虛線）

此外，盡管兩個(gè)過程的 EC50 值相似，但與壞死百分比相比，十字孢堿的最大平臺(tái)值的凋亡百分比達(dá)到了更高水平。這種差異可能表明，十字孢堿優(yōu)先啟動(dòng) HT-1080 細(xì)胞凋亡。因此，我們還使用 Gen5 對細(xì)胞凋亡和壞死信號(hào)的開始時(shí)間進(jìn)行了定量研究。結(jié)果表明只有十字孢堿的兩種信號(hào)開始時(shí)間存在差異，凋亡比壞死早約 3.5 小時(shí)。

該研究方法的優(yōu)勢與普適性

本應(yīng)用指南中推薦的研究方法具有顯著的優(yōu)勢和普適性。首先，該技術(shù)結(jié)合了自動(dòng)化和高通量的特點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)處理大量的樣本和數(shù)據(jù)，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。其次，通過無標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光成像的結(jié)合，研究者們能夠同時(shí)監(jiān)測癌細(xì)胞的增殖和死亡情況，從而獲得更加全面的信息。此外，該技術(shù)的普適性也很強(qiáng)，可以應(yīng)用于不同類型的癌細(xì)胞系和抗腫瘤藥物的篩選中。
 

設(shè)備推薦

Agilent BioTek Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)

Agilent BioTek Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)將自動(dòng)化數(shù)字顯微成像和微孔板檢測結(jié)合到了一個(gè)模塊化、可升級(jí)的平臺(tái)中。顯微成像模塊可在熒光、明場、高對比度明場、彩色明場和相差通道成像下提供高達(dá) 60 倍的放大倍率；溫控至 65 °C 和 CO2/O2 控制可為細(xì)胞成像工作流程提供穩(wěn)定條件。

Agilent BioTek BioSpa 全自動(dòng)培養(yǎng)箱

Agilent BioTek BioSpa全自動(dòng)培養(yǎng)箱與 Agilent BioTek Cytation 細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)整合，支持在多達(dá) 8 塊微孔板或其他樣品容器中實(shí)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)活細(xì)胞分析工作流程的自動(dòng)化。溫度和 CO2/O2 控制以及濕度監(jiān)測可為長時(shí)程活細(xì)胞成像工作流程提供有力支持。并可集成液體處理，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的流程自動(dòng)化。

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Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)