胞外基質(zhì)（ECM）作為細(xì)胞賴以生存的外界微環(huán)境，不僅為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，還通過與細(xì)胞表面受體的相互作用調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等關(guān)鍵生物學(xué)過程。在細(xì)胞生物學(xué)研究中，實現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的溫和解離、組織器官中細(xì)胞的精準(zhǔn)分離是開展實驗的前提。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）作為一種具有獨特底物特異性的中性金屬蛋白酶，能夠在保持細(xì)胞活性的前提下，選擇性降解細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、層粘連蛋白等關(guān)鍵成分，同時避免對細(xì)胞表面的蛋白造成過度損傷。因此，Neutral Protease II在原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)、組織器官中的細(xì)胞解離以及類器官研究中有著廣泛的應(yīng)用。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、化合物庫、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。

一、Neutral Protease II的作用機理
Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）是一種源自芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）的M4 家族金屬蛋白酶，其成熟肽鏈由約480個氨基酸殘基組成，Neutral Protease II 的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的 “沙漏型” 折疊，核心區(qū)域包含一個由鋅離子、兩個組氨酸（His）和一個谷氨酸（Glu）組成的活性中心，即 “HEXXH” 保守序列，這一結(jié)構(gòu)是金屬蛋白酶催化底物水解的關(guān)鍵位點。Neutral Protease II 具有嚴(yán)格的底物選擇性，主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白 IV 型等非纖維狀膠原成分，對 I 型、II 型等纖維狀膠原的降解活性較低。其底物識別位點通常為含有亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）等疏水氨基酸殘基的肽鍵，尤其偏好水解位于疏水性氨基酸 C 端的肽鍵，這種特異性使其能夠精準(zhǔn)解離細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接，而對細(xì)胞間直接連接（如緊密連接、橋粒）的影響較小。Neutral Protease II 的最適 pH 值范圍為 7.0-8.0，屬于中性蛋白酶，在生理 pH 環(huán)境下可保持較高的催化活性，Neutral Protease II 的最適反應(yīng)溫度為 37℃，與哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度一致，進(jìn)一步提升了其在細(xì)胞相關(guān)實驗中的適用性。此外，Neutral Protease II 的活性依賴于鋅離子的存在，EDTA 等金屬離子螯合劑可通過螯合鋅離子顯著抑制Neutral Protease II 的活性，而 Ca²⁺則對該酶的穩(wěn)定性具有一定的促進(jìn)作用，在反應(yīng)體系中添加適量 Ca²⁺可延長其活性維持時間。

二、Neutral Protease II在科研領(lǐng)域中的應(yīng)用
1. Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II）用于原代細(xì)胞分離
原代細(xì)胞因其保留了體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)特性，在細(xì)胞功能研究、藥物篩選模型的構(gòu)建等領(lǐng)域具有不可替代的作用。然而，組織中的細(xì)胞被大量胞外基質(zhì)包裹，傳統(tǒng)的機械研磨或胰蛋白酶消化方法往往存在細(xì)胞活性低、分離效率差等問題。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）憑借其溫和的解離特性，已成為多種組織原代細(xì)胞分離的首選工具酶之一。例如，在小鼠乳腺上皮細(xì)胞的分離中，將乳腺組織剪碎后用 Neutral Protease II在 37℃下孵育 1-2 小時，可有效降解乳腺組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，使上皮細(xì)胞團(tuán)從間質(zhì)組織中分離，后續(xù)再聯(lián)合Collagenase I 消化，即可獲得高活性的乳腺上皮單細(xì)胞懸液^{[1, 2]}。類似地，在神經(jīng)干細(xì)胞的分離中，Neutral Protease II 可用于從胼胝骨下方區(qū)域分離出神經(jīng)干細(xì)胞。相較于胰蛋白酶，Neutral Protease II 能更好地保留神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力和分化潛能，分離得到的細(xì)胞在體外培養(yǎng)體系中可形成更多的神經(jīng)球，且向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例更高^[3]。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國家心血管研究中心和美國哥倫比亞大學(xué)用于動物體內(nèi)實驗，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

圖 1. 利用Neutral Protease II從胼胝骨下區(qū)分離出神經(jīng)干細(xì)胞并形成神經(jīng)球^[3]

2. Neutral Protease II用于貼壁細(xì)胞傳代
對于某些貼壁生長能力較強的細(xì)胞系（如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞），傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化法可能導(dǎo)致細(xì)胞表面蛋白損傷，影響細(xì)胞的后續(xù)生長和功能。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可通過特異性降解細(xì)胞與培養(yǎng)皿表面之間的細(xì)胞外基質(zhì)成分（如纖維連接蛋白），實現(xiàn)細(xì)胞的溫和解離。在實際操作中，將 Neutral Protease II 溶液加入培養(yǎng)皿中，37℃孵育數(shù)分鐘后，細(xì)胞即可從培養(yǎng)皿表面脫落，且細(xì)胞聚集體較小，輕輕吹打即可分散，這可降低細(xì)胞機械損傷的風(fēng)險。研究表明，使用 Neutral Protease II 傳代的人皮膚成纖維細(xì)胞，其細(xì)胞活力和生長狀態(tài)要優(yōu)于傳統(tǒng)胰蛋白酶和EDTA消化的細(xì)胞，這表明Neutral Protease II 對某些細(xì)胞的生理功能影響更小^[4]。

3. Neutral Protease II用于組織器官解離
隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的快速發(fā)展，獲取高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液成為該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵前提。對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織器官（如肝臟、腎臟、肺臟），Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）常與其他酶，如膠原酶（Collagenase II，AbMole，M9973）、透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，AbMole，M9941）聯(lián)合使用，構(gòu)建高效的組織解離方案。以肌肉和骨骼組織為例，Neutral Protease II可聯(lián)合Collagenase I（膠原酶 I ） 、Collagenase II（膠原酶II） 、Pronase 等酶從上述組織中分離出包括間充質(zhì)干細(xì)胞、骨譜系細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的單細(xì)胞混合群，這為單細(xì)胞測序技術(shù)提供了基礎(chǔ)^[5]。

圖 2. 來自不同肌肉骨骼組織的單細(xì)胞分離方案示意圖^[5]

4. Neutral Protease II用于三維細(xì)胞培養(yǎng)與類器官構(gòu)建
類器官培養(yǎng)技術(shù)能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長微環(huán)境，更真實地反映細(xì)胞的生物學(xué)行為。在類器官（包括腫瘤類器官、胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的類器官）培養(yǎng)中，細(xì)胞一般接種于基質(zhì)膠等三維支架中。如何從基質(zhì)膠有效回收類器官細(xì)胞且不影響細(xì)胞的生物學(xué)參數(shù)，是類器官培養(yǎng)中的關(guān)鍵問題。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可用于類器官中的基質(zhì)膠降解和類器官的消化傳代。

圖 3. Dispase與其它基質(zhì)膠降方法的比較^[6]

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參考文獻(xiàn)及鳴謝
[1] John Stingl, Joanne T. Emerman, Connie J. Eaves, Enzymatic Dissociation and Culture of Normal Human Mammary Tissue to Detect Progenitor Activity, in: C.D. Helgason, C.L. Miller (Eds.), Basic Cell Culture Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 2005, pp. 249-263.
[2] Rana Mroue, Mina J. Bissell, Three-Dimensional Cultures of Mouse Mammary Epithelial Cells, in: S.H. Randell, M.L. Fulcher (Eds.), Epithelial Cell Culture Protocols: Second Edition, Humana Press, Totowa, NJ, 2013, pp. 221-250.
[3] J. Y. Kim, J. H. Lee, W. Sun, Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone, Journal of visualized experiments : JoVE (118) (2016).
[4] J. J. Cassiman, M. Brugmans, H. Van den Berghe, Growth and surface properties of dispase dissociated human fibroblasts, Cell Biology International Reports 5(2) (1981) 125-132.
[5] Manman Gao, Peng Guo, Xizhe Liu, et al., Systematic study of single-cell isolation from musculoskeletal tissues for single-sell sequencing, BMC Molecular and Cell Biology 23(1) (2022) 32.
[6] M. Wang, H. Yu, T. Zhang, et al., In-Depth Comparison of Matrigel Dissolving Methods on Proteomic Profiling of Organoids, Molecular & cellular proteomics : MCP 21(1) (2022) 100181.