Cytation1 高通量活細(xì)胞自噬體定量分析新方案
自噬 (Autophagy) 作為細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，通過溶酶體途徑降解并回收自身受損細(xì)胞器及錯(cuò)誤折疊蛋白，其動(dòng)態(tài)調(diào)控研究對(duì)癌癥、神經(jīng)退行性疾病及代謝綜合征等重大疾病機(jī)制解析具有關(guān)鍵意義。目前體外模型評(píng)價(jià)自噬的檢測(cè)手段包括電子顯微鏡、Western Bolt、構(gòu)建 GFP-LC3 熒光報(bào)告蛋白的細(xì)胞株等方法，但是這些方法或?yàn)榻K點(diǎn)法檢測(cè)、或需要較復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作或者只適合特定細(xì)胞系。基于此，來自德國團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一套基于 Cyto-ID® 染色 +Cytation 成像的絕對(duì)定量方案，輕松實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞自噬體評(píng)價(jià)。
方案主要特點(diǎn)
主要檢測(cè)原理
使用 780-1400 nm 的紅外光線輻照加熱細(xì)胞至 39℃，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬反應(yīng)，CYTO-ID 自噬檢測(cè)試劑盒的綠色染料能夠特異性標(biāo)記前自噬體、自噬體和自噬溶酶體，同時(shí)包含用于細(xì)胞核染色的 Hoechst 染料，以便能夠清晰定位每個(gè)細(xì)胞。通過加自噬體降解抑制劑氯喹作為陽性對(duì)照。細(xì)胞標(biāo)記后，通過熒光成像定量分析每個(gè)細(xì)胞的自噬體含量。
主要實(shí)驗(yàn)流程
1. 細(xì)胞準(zhǔn)備
2.1 分組處理：
設(shè)備：安捷倫 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀 （備注：該方案兼容 Cytation 系列所有設(shè)備）
成像設(shè)置：20X 物鏡下雙通道捕獲（DAPI 核信號(hào)+GFP 自噬體信號(hào)），每孔取 2 張中心區(qū)域圖像。
圖像處理：包括圖像去背景、去卷積處理，以獲得良好的用于分析的圖像
圖像分析：Primary Mask:識(shí)別細(xì)胞核（DAPI 信號(hào)）。Secondary Mask: 使用 Spot Count 功能統(tǒng)計(jì)核周自噬體數(shù)量（GFP 信號(hào)）。如下圖所示圖像處理后（A），在細(xì)胞核周圍設(shè)置預(yù)定義的 mask（B1-B2）。軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì) Mask 識(shí)別的每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的自噬體數(shù)量（B2）。
總結(jié)：為什么要選擇這套流程？
標(biāo)準(zhǔn)化：該方案提供了從細(xì)胞處理到數(shù)據(jù)分析全流程 SOP。
兼容性：可搭配 Cytation 的微孔板檢測(cè)系統(tǒng)拓展多重檢測(cè)（如細(xì)胞活力、ROS、線粒體膜電位等）。
應(yīng)用潛力：目前此方案已應(yīng)用于 ME/CFS 患者細(xì)胞研究，助力個(gè)性化熱療方案開發(fā)。
參考文獻(xiàn)
Hochecker, B. et al. (2024). Quantification of Autophagosomes in Human Fibroblasts Using Cyto-ID® Staining and Cytation Imaging. Bio-protocol 14(13): e5025. DOI: 10.21769/BioProtoc.5025.
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開發(fā)。
方案主要特點(diǎn)
- 活細(xì)胞中自噬小體的絕對(duì)定量
- 用于測(cè)定原代人皮膚成纖維細(xì)胞自噬的優(yōu)化方案
- 可測(cè)試活性物質(zhì)及治療手段對(duì)自噬的影響
- 基于自動(dòng)化成像技術(shù)的自噬測(cè)定方法
圖：該方案主要的實(shí)驗(yàn)流程圖
主要檢測(cè)原理
使用 780-1400 nm 的紅外光線輻照加熱細(xì)胞至 39℃，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬反應(yīng)，CYTO-ID 自噬檢測(cè)試劑盒的綠色染料能夠特異性標(biāo)記前自噬體、自噬體和自噬溶酶體，同時(shí)包含用于細(xì)胞核染色的 Hoechst 染料，以便能夠清晰定位每個(gè)細(xì)胞。通過加自噬體降解抑制劑氯喹作為陽性對(duì)照。細(xì)胞標(biāo)記后，通過熒光成像定量分析每個(gè)細(xì)胞的自噬體含量。
主要實(shí)驗(yàn)流程
1. 細(xì)胞準(zhǔn)備
- 使用原代人皮膚成纖維細(xì)胞（8 歲健康男性包皮來源，傳代 8-9 次）
- 解凍 5×10⁶ 細(xì)胞，500×g 離解凍 0.5×10⁶ 細(xì)胞，離心后接種至 T175 瓶，培養(yǎng) ≥48 小時(shí)恢復(fù)狀態(tài)
- 96 孔板每孔接種 5,000 細(xì)胞（100 μL DMEM），靜置 1 小時(shí)使均勻貼壁，培養(yǎng) 24 小時(shí)。
2.1 分組處理：
- 對(duì)照組：6 孔加普通 DMEM，6 孔加 0.5 μM 氯喹（陽性對(duì)照）。
- 熱療組：同法分組，采用 IRAcubator（39℃ 紅外-A 輻射，780-1400 nm）39℃ 處理 1 小時(shí)（對(duì)照組同步 37℃ 培養(yǎng)）。
- 注意：氯喹處理時(shí)間嚴(yán)格控制在 1 小時(shí)內(nèi)。
- 棄上清，用 1× assay buffer 輕柔洗滌 2 次。
- 加入 100 μL 染色液（含 CYTO-ID® 綠染劑 +Hoechst 核染），避光孵育 30 分鐘。
- 再次洗滌后，加 100 μL assay buffer 立即成像。
設(shè)備：安捷倫 BioTek Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀 （備注：該方案兼容 Cytation 系列所有設(shè)備）
圖像處理：包括圖像去背景、去卷積處理，以獲得良好的用于分析的圖像
圖像分析：Primary Mask:識(shí)別細(xì)胞核（DAPI 信號(hào)）。Secondary Mask: 使用 Spot Count 功能統(tǒng)計(jì)核周自噬體數(shù)量（GFP 信號(hào)）。如下圖所示圖像處理后（A），在細(xì)胞核周圍設(shè)置預(yù)定義的 mask（B1-B2）。軟件自動(dòng)統(tǒng)計(jì) Mask 識(shí)別的每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的自噬體數(shù)量（B2）。
總結(jié)：為什么要選擇這套流程？
標(biāo)準(zhǔn)化：該方案提供了從細(xì)胞處理到數(shù)據(jù)分析全流程 SOP。
- ✦絕對(duì)定量：自動(dòng)化的成像方案保證在一致的成像條件下進(jìn)行樣本的定量分析，直接計(jì)算“自噬體/細(xì)胞核”數(shù)量，告別 Western Blot 的半定量模糊性。
- ✦活細(xì)胞友好：無需固定或裂解細(xì)胞，保持生理狀態(tài)。
- ✦高通量：96 孔板設(shè)計(jì)，1 小時(shí)內(nèi)完成多組平行檢測(cè)，適合高通量篩選。
- ✦適配性強(qiáng)：可擴(kuò)展至其他治療（如藥物篩選）或細(xì)胞類型（如 HeLa）。
- ✦低成本：相比其他復(fù)雜制樣過程，該方案從染色到分析僅需兩小時(shí)，且無需昂貴抗體或特殊耗材。
兼容性：可搭配 Cytation 的微孔板檢測(cè)系統(tǒng)拓展多重檢測(cè)（如細(xì)胞活力、ROS、線粒體膜電位等）。
應(yīng)用潛力：目前此方案已應(yīng)用于 ME/CFS 患者細(xì)胞研究，助力個(gè)性化熱療方案開發(fā)。
Cytation 系列檢測(cè)平臺(tái)能夠提供多種靈活通量的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞篩選檢測(cè)方案
參考文獻(xiàn)
Hochecker, B. et al. (2024). Quantification of Autophagosomes in Human Fibroblasts Using Cyto-ID® Staining and Cytation Imaging. Bio-protocol 14(13): e5025. DOI: 10.21769/BioProtoc.5025.
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 1 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開發(fā)。
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