Pipetty電動移液器在狂犬病毒檢測（RT-RPA）中的應(yīng)用
方案摘要：狂犬病毒檢測中的RT-RPA 技術(shù)，全稱為逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification），是一種針對狂犬病毒（RNA 病毒）的快速、靈敏的分子檢測方法，核心用于體外檢測樣本中狂犬病毒的 RNA，廣泛應(yīng)用于動物檢疫、疑似病例篩查等場景。本方案使用了Pipetty電動移液器，其 75g 超輕筆式設(shè)計降低手部負擔(dān)，減少肌腱炎風(fēng)險，握筆式操作適配狹小加樣空間。連續(xù)分液功能使操作時間縮短 1/2-2/3，單槍可實現(xiàn) 10μL 液量 25 次重復(fù)分配，大幅提升微孔板加樣效率，為實驗標準化提供關(guān)鍵支撐。
方案詳情：
一、實驗原理
狂犬病毒檢測（RT-RPA）核心是逆轉(zhuǎn)錄與重組酶介導(dǎo)等溫擴增的協(xié)同作用，針對狂犬病毒（單鏈 RNA 病毒）特性，分兩步實現(xiàn)病毒 RNA 的高效檢測。第一步為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：樣本中提取的狂犬病毒 RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，以 RNA 為模板合成互補 DNA（cDNA），解決 RNA 無法直接被 DNA 聚合酶擴增的問題，為后續(xù)擴增提供底物。第二步為等溫擴增反應(yīng)：在 37-42℃恒溫條件下，重組酶與特異性引物結(jié)合形成復(fù)合物，快速掃描 cDNA 并定位匹配序列；單鏈結(jié)合蛋白（SSB）隨即結(jié)合解開的 DNA 單鏈，防止其復(fù)性；DNA 聚合酶沿引物 3' 端延伸，實現(xiàn) cDNA 指數(shù)級擴增。同時，反應(yīng)體系中的熒光探針或標記引物隨擴增釋放信號，最終通過熒光強度或試紙條條帶，判定樣本中是否存在狂犬病毒 RNA。
二、實驗準備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型臺式冷凍離心機；
④ 熒光PCR 儀；
2、試劑和材料
① 狂大病病毒陽性對照腦組織；
② 狂大病病毒陰性對照腦組織；
③ 特異性引物和探針。
引物 RPA-F:5'-ATGGATGCCGACAAGATTGTMTTYAAAGTYAATAATCA。
引物RPA-R:5'-CTGGTCCAGTCYTCMGGRCATGTYCCCTCAAA.
探針RPA-P:5'-TCAAATCTTTGATAGCAGGGTACTTGTACTCA(FAM-dT)AT(THF)
GA(BHQ-dT)CCACGATAATC-*。其中*代表阻止引物延伸的基團,可采用磷酸化或者 C3spacer修飾實現(xiàn)。
④ RNA 提取試劑盒(商品化試劑)。
⑤ 反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴增(RT-RPA)試劑盒(商品化試劑)。
三、實驗步驟
1、分別從不同部位待檢腦組織(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g，樣品量少時可取全部組織。剪碎混勻,取其中約1g置組織勻漿器中,加入1mL生理鹽水進行勻漿,以3000g離心2min 后取 100μL,勻漿上清于 1.5 mL滅菌離心管中。使用Pipetty電動移液器，狂犬病病毒陽性和陰性對照腦組織各取 100μL分別置于 1.5 mL 滅菌離心管中。唾液樣品直接取 100μL, 置于 1.5 mL滅菌離心管中。
2、使用Pipetty電動移液器，使用 RNA 提取試劑盒,按試劑盒說明書提取待檢樣品和對照樣品總 RNA。
3、用無 RNA 酶水將引物溶解或稀釋至濃度 10 μmol/L。
4、使用反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴增(RT-RPA)試劑盒,按說明書配制 50 μL反應(yīng)體系,設(shè)置連續(xù)分液模式，加入經(jīng)稀釋的引物 RPA-F、RPA-R 各 2.1 μL,探針 RPA-P 0.6 μL,總 RNA 模板2μL,混勻后加入混合酶反應(yīng)管(試劑盒組分),最后加入 280 mmol/L,醋酸鎂(試劑盒組分)2.5μL。同時設(shè)置狂犬病病毒陽性對照樣品、陰性對照樣品和反應(yīng)體系空白對照(不加模板 RNA)。
4、配制好的反應(yīng)體系應(yīng)立即上機擴增。使用熒光定量 PCR 儀時,設(shè)置 39 ℃擴增 30s,45 個循環(huán),于反應(yīng)全程收集 FAM 熒光信號;使用等溫擴增檢測儀時,39 ℃擴增5 min后,取出反應(yīng)管顛倒混勻,短時離心后再以 39 ℃繼續(xù)擴增 17.5 min,在 17.5 min 反應(yīng)全程收集 FAM 熒光信號。
四、結(jié)果判定
1、狂犬病病毒陰性對照樣品無熒光曲線或 Ct>42,陽性對照樣品 Ct≤30,反應(yīng)體系空白對照無熒光曲線時判定檢測反應(yīng)成立。
2、待測樣品 Ct≤37 時判定為狂犬病病毒核酸陽性;無熒光曲線或 Ct>42 時判定為狂犬病病毒核酸陰性;37
方案詳情：
一、實驗原理
狂犬病毒檢測（RT-RPA）核心是逆轉(zhuǎn)錄與重組酶介導(dǎo)等溫擴增的協(xié)同作用，針對狂犬病毒（單鏈 RNA 病毒）特性，分兩步實現(xiàn)病毒 RNA 的高效檢測。第一步為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：樣本中提取的狂犬病毒 RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，以 RNA 為模板合成互補 DNA（cDNA），解決 RNA 無法直接被 DNA 聚合酶擴增的問題，為后續(xù)擴增提供底物。第二步為等溫擴增反應(yīng)：在 37-42℃恒溫條件下，重組酶與特異性引物結(jié)合形成復(fù)合物，快速掃描 cDNA 并定位匹配序列；單鏈結(jié)合蛋白（SSB）隨即結(jié)合解開的 DNA 單鏈，防止其復(fù)性；DNA 聚合酶沿引物 3' 端延伸，實現(xiàn) cDNA 指數(shù)級擴增。同時，反應(yīng)體系中的熒光探針或標記引物隨擴增釋放信號，最終通過熒光強度或試紙條條帶，判定樣本中是否存在狂犬病毒 RNA。
二、實驗準備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型臺式冷凍離心機；
④ 熒光PCR 儀；
2、試劑和材料
① 狂大病病毒陽性對照腦組織；
② 狂大病病毒陰性對照腦組織；
③ 特異性引物和探針。
引物 RPA-F:5'-ATGGATGCCGACAAGATTGTMTTYAAAGTYAATAATCA。
引物RPA-R:5'-CTGGTCCAGTCYTCMGGRCATGTYCCCTCAAA.
探針RPA-P:5'-TCAAATCTTTGATAGCAGGGTACTTGTACTCA(FAM-dT)AT(THF)
GA(BHQ-dT)CCACGATAATC-*。其中*代表阻止引物延伸的基團,可采用磷酸化或者 C3spacer修飾實現(xiàn)。
④ RNA 提取試劑盒(商品化試劑)。
⑤ 反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴增(RT-RPA)試劑盒(商品化試劑)。
三、實驗步驟
1、分別從不同部位待檢腦組織(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g，樣品量少時可取全部組織。剪碎混勻,取其中約1g置組織勻漿器中,加入1mL生理鹽水進行勻漿,以3000g離心2min 后取 100μL,勻漿上清于 1.5 mL滅菌離心管中。使用Pipetty電動移液器，狂犬病病毒陽性和陰性對照腦組織各取 100μL分別置于 1.5 mL 滅菌離心管中。唾液樣品直接取 100μL, 置于 1.5 mL滅菌離心管中。
2、使用Pipetty電動移液器，使用 RNA 提取試劑盒,按試劑盒說明書提取待檢樣品和對照樣品總 RNA。
3、用無 RNA 酶水將引物溶解或稀釋至濃度 10 μmol/L。
4、使用反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴增(RT-RPA)試劑盒,按說明書配制 50 μL反應(yīng)體系,設(shè)置連續(xù)分液模式，加入經(jīng)稀釋的引物 RPA-F、RPA-R 各 2.1 μL,探針 RPA-P 0.6 μL,總 RNA 模板2μL,混勻后加入混合酶反應(yīng)管(試劑盒組分),最后加入 280 mmol/L,醋酸鎂(試劑盒組分)2.5μL。同時設(shè)置狂犬病病毒陽性對照樣品、陰性對照樣品和反應(yīng)體系空白對照(不加模板 RNA)。
4、配制好的反應(yīng)體系應(yīng)立即上機擴增。使用熒光定量 PCR 儀時,設(shè)置 39 ℃擴增 30s,45 個循環(huán),于反應(yīng)全程收集 FAM 熒光信號;使用等溫擴增檢測儀時,39 ℃擴增5 min后,取出反應(yīng)管顛倒混勻,短時離心后再以 39 ℃繼續(xù)擴增 17.5 min,在 17.5 min 反應(yīng)全程收集 FAM 熒光信號。
四、結(jié)果判定
1、狂犬病病毒陰性對照樣品無熒光曲線或 Ct>42,陽性對照樣品 Ct≤30,反應(yīng)體系空白對照無熒光曲線時判定檢測反應(yīng)成立。
2、待測樣品 Ct≤37 時判定為狂犬病病毒核酸陽性;無熒光曲線或 Ct>42 時判定為狂犬病病毒核酸陰性;37
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