Pipetty電動(dòng)移液器在犬細(xì)小病毒檢測(cè)（熒光PCR實(shí)驗(yàn)）中的應(yīng)用
方案摘要：熒光 PCR 技術(shù)，是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)結(jié)合熒光探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒核酸（DNA）進(jìn)行高靈敏、高特異、可定量檢測(cè)的分子生物學(xué)方法，廣泛應(yīng)用于臨床快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查及疫苗效果評(píng)估等場(chǎng)景。為提升實(shí)驗(yàn)效率，本方案使用了Pipetty電動(dòng)移液器，通過(guò)其自動(dòng)混勻和連續(xù)分液功能，提高上樣效率，并且由于其體積小，重量輕，在提高效率的同時(shí)，還能減少操作者的手部疲勞。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
犬細(xì)小病毒（CPV）熒光 PCR 實(shí)驗(yàn)基于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)，核心是通過(guò)特異性核酸擴(kuò)增與熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)病毒檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)針對(duì) CPV 高度保守的 VP2 基因設(shè)計(jì)特異性引物與 TaqMan 熒光探針 —— 探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)，未反應(yīng)時(shí)淬滅基團(tuán)抑制熒光信號(hào)。PCR 反應(yīng)中，Taq 酶延伸引物時(shí)，其 5'→3' 外切酶活性水解結(jié)合靶序列的探針，使兩基團(tuán)分離，釋放熒光。熒光信號(hào)強(qiáng)度與 PCR 產(chǎn)物量（即初始 CPV DNA 量）正相關(guān)，通過(guò)儀器實(shí)時(shí)采集信號(hào)，以熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（Ct 值）及 “S 型” 擴(kuò)增曲線判讀結(jié)果，兼具高靈敏度、高特異性與定量能力。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；
② 冰箱(4℃、-20 ℃、-70 ℃)；
③ 熒光 PCR 儀；
④ 高速冷凍離心機(jī)(4℃、離心速度12000r/min 以上)；
⑤ 無(wú)DNA酶離心管與帶濾芯吸頭。
2、試劑和材料
① DEPC水(0.1%)；
② Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)；
③ 反應(yīng)緩沖液；
④ MgCl2 ；
⑤ dNTP Mix；
⑥ Taq 酶。
⑦ 上游引物(PrimerF):5'-GACAATCTTGCACCAATGAG-3'；
下游引物(PrimerR):5'-CCAGATCCTGTAGCTCTTTC-3'；
Primer P:5'-(FAM)TGGAGCAGTTCAACCAGACGG(BHQ1)-3'。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、用DEPC水作為CPV陰性對(duì)照，用CPV的細(xì)胞培養(yǎng)物作為CPV陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)酶水作為空白對(duì)照。
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器，取處理好的待檢樣品上清液500μL置于1.5mL無(wú)DNA酶離心管中，加入500μL DNAiso Reagent 試劑，顛倒混勻6次~8次，靜置約10 min后，12 000 r/min 離心 10 min。
3、取上清液(至少500 μL)至新的 1.5 ml無(wú) DNA酶離心管中，每管加入 400 μL無(wú)水乙醇，顛倒混勻6次~8次，4000r/min離心2min。
4、 小心棄掉上清液，加1mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，顛倒混勻6次~8次，12000 r/min離心5 min。
5、小心棄掉上清液，倒置在干凈的吸水紙上晾干水分，加入20μL DEPC水溶解DNA沉淀。-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 注：可以使用等效的商品化試劑盒進(jìn)行DNA提取。
6、使用Pipetty電動(dòng)移液器，根據(jù)表2的熒光PCR反應(yīng)體系，設(shè)置單次分液模式，將除DNA模板之外的試劑按照所需孔數(shù)計(jì)算體積并×10%，移取至離心管中，混勻模式，自動(dòng)混勻。
7、設(shè)置連續(xù)分液模式，將混合好的試劑和DNA模板分別加入到96孔板中，離心。
8、將PCR管置熒光 PCR儀上按如下程序擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，60℃退火延伸30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)60℃收集FAM 熒光。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件
a) 陰性對(duì)照無(wú)Ct值或C≥40,且無(wú)特定的S型擴(kuò)增曲線;
b) 陽(yáng)性對(duì)照的Ct＜35,且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線;
c) 陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)滿足以上條件可判定試驗(yàn)有效,否則試驗(yàn)無(wú)效;
2、 結(jié)果描述及判定
a） 無(wú)Ct值或Ct≥40,目無(wú)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為CPV核酸陰性。
b) Ct≤38,且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為CPV核酸陽(yáng)性,擴(kuò)增曲線圖見(jiàn)附錄D。
c) 38＜Ct＜40且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為可疑。在排除樣本或產(chǎn)物污染的可能性后,重新提取核酸檢測(cè),無(wú) Ct值或 Ct≥40且無(wú)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為 CPV 核酸陰性,Ct＜40且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為CPV核酸陽(yáng)性。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
犬細(xì)小病毒（CPV）熒光 PCR 實(shí)驗(yàn)基于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)，核心是通過(guò)特異性核酸擴(kuò)增與熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)病毒檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)針對(duì) CPV 高度保守的 VP2 基因設(shè)計(jì)特異性引物與 TaqMan 熒光探針 —— 探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)，未反應(yīng)時(shí)淬滅基團(tuán)抑制熒光信號(hào)。PCR 反應(yīng)中，Taq 酶延伸引物時(shí)，其 5'→3' 外切酶活性水解結(jié)合靶序列的探針，使兩基團(tuán)分離，釋放熒光。熒光信號(hào)強(qiáng)度與 PCR 產(chǎn)物量（即初始 CPV DNA 量）正相關(guān)，通過(guò)儀器實(shí)時(shí)采集信號(hào)，以熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（Ct 值）及 “S 型” 擴(kuò)增曲線判讀結(jié)果，兼具高靈敏度、高特異性與定量能力。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；
② 冰箱(4℃、-20 ℃、-70 ℃)；
③ 熒光 PCR 儀；
④ 高速冷凍離心機(jī)(4℃、離心速度12000r/min 以上)；
⑤ 無(wú)DNA酶離心管與帶濾芯吸頭。
2、試劑和材料
① DEPC水(0.1%)；
② Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2X)；
③ 反應(yīng)緩沖液；
④ MgCl2 ；
⑤ dNTP Mix；
⑥ Taq 酶。
⑦ 上游引物(PrimerF):5'-GACAATCTTGCACCAATGAG-3'；
下游引物(PrimerR):5'-CCAGATCCTGTAGCTCTTTC-3'；
Primer P:5'-(FAM)TGGAGCAGTTCAACCAGACGG(BHQ1)-3'。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、用DEPC水作為CPV陰性對(duì)照，用CPV的細(xì)胞培養(yǎng)物作為CPV陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)酶水作為空白對(duì)照。
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器，取處理好的待檢樣品上清液500μL置于1.5mL無(wú)DNA酶離心管中，加入500μL DNAiso Reagent 試劑，顛倒混勻6次~8次，靜置約10 min后，12 000 r/min 離心 10 min。
3、取上清液(至少500 μL)至新的 1.5 ml無(wú) DNA酶離心管中，每管加入 400 μL無(wú)水乙醇，顛倒混勻6次~8次，4000r/min離心2min。
4、 小心棄掉上清液，加1mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，顛倒混勻6次~8次，12000 r/min離心5 min。
5、小心棄掉上清液，倒置在干凈的吸水紙上晾干水分，加入20μL DEPC水溶解DNA沉淀。-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 注：可以使用等效的商品化試劑盒進(jìn)行DNA提取。
6、使用Pipetty電動(dòng)移液器，根據(jù)表2的熒光PCR反應(yīng)體系，設(shè)置單次分液模式，將除DNA模板之外的試劑按照所需孔數(shù)計(jì)算體積并×10%，移取至離心管中，混勻模式，自動(dòng)混勻。
7、設(shè)置連續(xù)分液模式，將混合好的試劑和DNA模板分別加入到96孔板中，離心。
8、將PCR管置熒光 PCR儀上按如下程序擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，60℃退火延伸30s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)60℃收集FAM 熒光。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件
a) 陰性對(duì)照無(wú)Ct值或C≥40,且無(wú)特定的S型擴(kuò)增曲線;
b) 陽(yáng)性對(duì)照的Ct＜35,且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線;
c) 陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)滿足以上條件可判定試驗(yàn)有效,否則試驗(yàn)無(wú)效;
2、 結(jié)果描述及判定
a） 無(wú)Ct值或Ct≥40,目無(wú)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為CPV核酸陰性。
b) Ct≤38,且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為CPV核酸陽(yáng)性,擴(kuò)增曲線圖見(jiàn)附錄D。
c) 38＜Ct＜40且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為可疑。在排除樣本或產(chǎn)物污染的可能性后,重新提取核酸檢測(cè),無(wú) Ct值或 Ct≥40且無(wú)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為 CPV 核酸陰性,Ct＜40且出現(xiàn)特定的S型擴(kuò)增曲線,判為CPV核酸陽(yáng)性。
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