CircPRKD3/miR-6783-3p responds to mechanical force to facilitate the osteogenesis of stretched periodontal ligament stem cells

Keywords: CircPRKD3, miR-6783-3p, ceRNAs, PDLSCs, Mechanical force

外在機(jī)械力介導(dǎo)牙槽骨組織重建時(shí)，牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）是機(jī)械力轉(zhuǎn)化為骨重塑生物信號(hào)的關(guān)鍵，其經(jīng)牽張誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后，可通過調(diào)控破骨細(xì)胞影響骨重建方向，因此明確其在機(jī)械力下的成骨分化機(jī)制十分重要。

非編碼 RNA（ncRNAs）因在人類基因組中占比高且功能廣泛受到關(guān)注，在此前已明確 miR-21 和 lncRNA SNHG8-EZH2 軸對(duì)機(jī)械刺激下 PDLSCs 成骨的抑制作用。而環(huán)狀 RNA（circRNAs）因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定成為新的研究重點(diǎn)，雖然機(jī)械力作用下環(huán)狀 RNA 的表達(dá)譜主要集中在轉(zhuǎn)錄、翻譯、能量代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及通訊等方面 ，但具體調(diào)控模式不明。鑒于環(huán)狀 RNA 可作為微小 RNA “海綿”，結(jié)合此前 miR-21 對(duì) PDLSCs 成骨的調(diào)控研究，研究人員預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了與 miR-21 相關(guān)的環(huán)狀 RNA，發(fā)現(xiàn) circPRKD3 在機(jī)械負(fù)荷下的 PDLSCs 中變化zui顯著。

CircPRKD3 是一種 943nt 的環(huán)狀 RNA，目前其功能尚未被研究報(bào)道。不過其親本基因 PRKD3 的相關(guān)功能已有較多發(fā)現(xiàn)：它在腫瘤發(fā)生時(shí)表達(dá)異常，是潛在癌基因；能影響肝硬化肝組織中巨噬細(xì)胞極化和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 生成；還參與 MMP1/13 調(diào)控的促炎過程，與軟骨基質(zhì)降解、多核成熟破骨細(xì)胞分化相關(guān)，且關(guān)聯(lián)骨修復(fù)過程。

基于此，山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì) PDLSCs 施加機(jī)械刺激，同時(shí)利用慢病毒構(gòu)建體實(shí)現(xiàn) circPRKD3 的敲低、利用質(zhì)粒實(shí)現(xiàn) circPRKD3 的過表達(dá)，以此研究 circPRKD3 在機(jī)械刺激條件下的成骨功能，并闡明其潛在的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究成果發(fā)表在Journal of orthopaedic surgery and research期刊，題為“CircPRKD3/miR-6783-3p responds to mechanical force to facilitate the osteogenesis of stretched periodontal ligament stem cells”。

首先，研究人員對(duì)分離的 PDLSCs 進(jìn)行了鑒定并分析其生物學(xué)特性。形態(tài)上，分離得到的 PDLSCs 呈長(zhǎng)梭形（圖 1A）。流式細(xì)胞術(shù)顯示其表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物（包括 CD73、CD90、CD146 和 STRO-1 ），不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物 CD34 和白細(xì)胞標(biāo)志物 CD45 （圖 1B）。功能上，ALP染色結(jié)果顯示 ALP 活性升高（圖 1C、D）；茜素紅染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)鈣化增強(qiáng)，這表明 PDLSCs 具有成骨分化能力（圖 1E、F）。這些結(jié)果表明該 PDLSCs 具備多向分化潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的基本標(biāo)準(zhǔn)。

圖1    PDLSCs 的鑒定及生物學(xué)特性。

為了研究機(jī)械刺激對(duì) PDLSCs 及 circPRKD3 的影響，研究人員對(duì)PDLSCs 施加牽張刺激。體外機(jī)械刺激的PDLSCs 示意圖如圖 2A 所示 。結(jié)果顯示，與未受牽張誘導(dǎo)、排列雜亂的 PDLSCs（圖 2B）相比，受到機(jī)械力作用的 PDLSCs 沿受力方向排列，形態(tài)呈牽張狀態(tài)（圖 2C），機(jī)械力的施加增強(qiáng)了 PDLSCs 的成骨潛能（圖 2E-I）。同時(shí)，機(jī)械刺激會(huì)使 circPRKD3 的表達(dá)上調(diào)（圖 2D），提示其可能參與牽張誘導(dǎo)的 PDLSCs 成骨過程。此外，通過數(shù)據(jù)庫查詢和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，circPRKD3 存在特定剪接連接點(diǎn)（圖 2J），且具有最小自由能的 circPRKD3 預(yù)測(cè)出兩種結(jié)構(gòu)（圖 2K-O），這表明 circPRKD3 的 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)具有多樣性。  
 

圖2    機(jī)械刺激的 PDLSCs 成骨發(fā)育過程中 circPRKD3 表達(dá)上調(diào)。

接著，研究了 circPRKD3 在機(jī)械刺激下 PDLSCs 成骨過程中的功能，研究人員選擇下調(diào)效果佳的序列靶點(diǎn) 57219-1，設(shè)計(jì)并合成了慢病毒載體（圖 3A）。后續(xù)的熒光成像（圖 3B）和 qRT-PCR （圖 3C） 分析結(jié)果證實(shí)，通過該病毒轉(zhuǎn)染能有效敲低 circPRKD3。為了明確下調(diào) circPRKD3 對(duì)機(jī)械刺激下 PDLSCs 成骨分化潛能的影響，研究人員對(duì)陰性對(duì)照（sh-NC）和 circPRKD3 敲低（sh-circPRKD3）兩組 PDLSCs 施加 24 小時(shí)機(jī)械力刺激。結(jié)果顯示，circPRKD3 敲低后，成骨相關(guān)分子 ALP 和 RUNX2 在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá)均顯著降低（圖 3D-3H），由此證實(shí)下調(diào) circPRKD3 會(huì)抑制牽張誘導(dǎo)的 PDLSCs 成骨。

為了進(jìn)一步明確 circPRKD3 的功能，研究人員在之前 circPRKD3 敲低實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開展了過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。通過擴(kuò)增 circPRKD3 全長(zhǎng)序列，利用EcoRI 和 BamHI 兩種限制酶將其連接到 pLC5-ciR 載體（圖 3I）。合成序列無雜峰和重疊條帶（圖 3I），表明 circPRKD3 的基因片段已成功插入 pLC5-ciR 載體。隨后將相關(guān)質(zhì)粒保存于甘油菌中，借助氨芐青霉素篩選出含circPRKD3 過表達(dá)質(zhì)粒的純凈大腸桿菌（圖 3K）。從大腸桿菌中提取質(zhì)粒并驗(yàn)證純度后，檢測(cè)circPRKD3 在 293T 細(xì)胞和 PDLSCs 中的過表達(dá)效率（圖 3L、M），發(fā)現(xiàn) PDLSCs 轉(zhuǎn)染效率顯著低于 293T 細(xì)胞，推測(cè)與原代細(xì)胞和細(xì)胞系對(duì)轉(zhuǎn)染試劑的反應(yīng)性差異有關(guān)。

然后，為了進(jìn)一步探究 circPRKD3 的成骨作用，研究人員對(duì)陰性對(duì)照載體（pLC5-ciR-NC）和 circPRKD3 過表達(dá)載體（pLC5-circPRKD3）兩組 PDLSCs 施加 24 小時(shí)機(jī)械力刺激。結(jié)果顯示，circPRKD3 過表達(dá)后，RUNX2 在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)均增強(qiáng)（3O、P、R），ALP 僅在 mRNA 水平表達(dá)上調(diào)（圖 3N、P、Q）。這一結(jié)果初步證明了 circPRKD3 在牽張誘導(dǎo)的 PDLSCs 成骨過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

圖3    circPRKD3 的調(diào)控對(duì)機(jī)械刺激下 PDLSCs 成骨的影響。

接下來，為進(jìn)一步探究 circPRKD3 的功能機(jī)制，研究人員研究了 circPRKD3 在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中的分布情況。首先通過核質(zhì)分布研究發(fā)現(xiàn)，盡管 circPRKD3 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布（圖 4A），但在 PDLSCs 的細(xì)胞質(zhì)中占比更高（圖 4B）�；�于細(xì)胞質(zhì)中 miRNAs 可與 circRNAs 形成 “海綿” 作用的特性，研究借助四種算法預(yù)測(cè)出 225 個(gè)可能與 circPRKD3 相互作用的 miRNAs，經(jīng) miRDB 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選至 34 個(gè)（圖 4C）。隨后隨機(jī)選取 10 個(gè) miRNAs 驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn) miR-761、miR-6783-3p、miR-6516-5p、miR-7855-5p 和 miR-214-3p 這 5 個(gè)機(jī)械敏感 miRNAs 在機(jī)械力作用下表達(dá)上調(diào)（圖 4D），且這一趨勢(shì)與 circPRKD3 在牽張誘導(dǎo)下的上調(diào)趨勢(shì)一致。

為了明確受 circPRKD3 調(diào)控的 miRNAs，研究人員發(fā)現(xiàn) circPRKD3 過表達(dá)會(huì)使 miR-6783-3p 和 miR-7855-5p 表達(dá)下降（圖 4E），但 circPRKD3 敲低對(duì)二者無顯著影響（圖 4F）。其中 miR-6783-3p 在轉(zhuǎn)錄水平變化zui明顯，通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到它與 circPRKD3 存在潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖 4G）。進(jìn)一步的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-6783-3p 模擬物可降低野生型 circPRKD3 報(bào)告基因的熒光素酶活性，而對(duì)突變型無影響（圖 4H），由此確定 circPRKD3 與 miR-6783-3p 能夠相互結(jié)合。

圖4    circPRKD3 下游靶點(diǎn)的篩選與驗(yàn)證 免疫熒光染色。

然后，為了探究 miR-6783-3p 與 circPRKD3 的相互作用對(duì)機(jī)械刺激下 PDLSCs 成骨的影響，研究人員首先合成 miR-6783-3p 模擬物并確認(rèn)其能增強(qiáng)該 miRNA 的調(diào)控功能（圖 5A）。對(duì)轉(zhuǎn)染該模擬物的 PDLSCs 施加24小時(shí)機(jī)械刺激后發(fā)現(xiàn)，miR-6783-3p 可使 RUNX2 轉(zhuǎn)錄表達(dá)升高（圖 5C），但 ALP 的表達(dá)水平變化并不顯著（圖 5B）。不過，RUNX2 與 ALP 在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均顯著增加（圖 5D-F）。這一結(jié)果證實(shí)，在機(jī)械負(fù)荷下，miR-6783-3p 和 circPRKD3 一樣，均能對(duì) PDLSCs 的成骨過程起到促進(jìn)作用。

最后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了 miR-6783-3p 與 circPRKD3 的 “海綿” 關(guān)系。共轉(zhuǎn)染二者的 PDLSCs 成骨蛋白表達(dá)水平低于單獨(dú)轉(zhuǎn)染組（圖 5G-I），說明 miR-6783-3p 可吸附 circPRKD3 調(diào)控牽張誘導(dǎo)的 PDLSCs 成骨。同時(shí)，針對(duì) RUNX2 的檢測(cè)顯示，circPRKD3 和 miR-6783-3p 并不直接結(jié)合其蛋白序列（圖 5J）。最終證實(shí)，circPRKD3 與 miR-6783-3p 通過相互 “海綿” 作用，間接調(diào)控機(jī)械刺激下 PDLSCs 的成骨過程。綜上，circPRKD3 與 miR-6783-3p 通過相互 “海綿” 作用間接調(diào)控機(jī)械刺激下 PDLSCs 的成骨過程（圖 5K）。

圖 5 miR-6783-3p 與 circPRKD3 的相互作用調(diào)控機(jī)械刺激下牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的成骨

總之，該研究明確了 circPRKD3 在機(jī)械力介導(dǎo)的 PDLSCs 成骨分化中表達(dá)上調(diào)，且其通過吸附 miR-6783-3p作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 RNA 來調(diào)控成骨過程。同時(shí)證實(shí) miR-6783-3p 對(duì)骨形成有正向作用�；�于這些發(fā)現(xiàn)，circPRKD3 作為關(guān)鍵成骨調(diào)控因子，未來在牙周組織再生和正畸牙齒移動(dòng)等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：Liu J, Liu R, Wang H, Zhang Z, Wang J, Wei F. CircPRKD3/miR-6783-3p responds to mechanical force to facilitate the osteogenesis of stretched periodontal ligament stem cells. J Orthop Surg Res. 2024 Apr 22;19(1):257. doi: 10.1186/s13018-024-04727-7. PMID: 38649946; PMCID: PMC11036753.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38649946/
Impact Factor: 2.8
ISSN: 1749-799X

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