Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis

Keywords: OSS; PSS; Autophagy ; Autophagic flux; Mitochondrial homeostasis.

自噬是一種進(jìn)化保守且受嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞過程，通過降解蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等成分維持細(xì)胞功能，其調(diào)控與 ATG 基因激活相關(guān)，ULK-Atg17 復(fù)合物、mTOR 等參與其中，ATG8/LC3 家族、ATG5 在自噬體形成中起關(guān)鍵作用，p62 積累是自噬流受損的標(biāo)志。自噬功能失調(diào)與心血管疾病等多種病理狀態(tài)相關(guān)，而氧化應(yīng)激是自噬的主要誘導(dǎo)因素，ox-LDL 等可誘導(dǎo)自噬并伴隨 mtDNA 損傷，線粒體因缺乏組蛋白保護(hù)易受氧化應(yīng)激影響。

剪切應(yīng)力對血管內(nèi)皮細(xì)胞有代謝和機(jī)械雙重作用，與動脈粥樣硬化的局灶性相關(guān)。動脈分叉處血流模式復(fù)雜，側(cè)壁的振蕩剪切應(yīng)力（OSS）會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，通過激活 NADPH 氧化酶和 JNK 導(dǎo)致線粒體超氧化物增加、mtDNA 損傷等；中壁的脈動剪切應(yīng)力（PSS）則下調(diào)炎癥和氧化應(yīng)激。研究表明，OSS 可誘導(dǎo)自噬但損傷自噬流，促進(jìn)線粒體功能障礙等；PSS 則情況相反，而剪切應(yīng)力的空間和時間變化在很大程度上決定了血管氧化應(yīng)激和促炎狀態(tài)的局灶性，不過血流剪切應(yīng)力與自噬之間的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍不明確。

基于此，美國加州大學(xué)洛杉磯分校戴維・格芬醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)系的研究團(tuán)隊通過研究剪切應(yīng)力的時間和空間變化與血管代謝效應(yīng)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)OSS 損傷自噬流，從而干擾線粒體穩(wěn)態(tài)。 研究結(jié)果發(fā)表在Antioxidants & redox signaling期刊，題為“Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis”。

首先，為了探究剪切應(yīng)力空間變化與自噬的關(guān)系，研究通過計算流體動力學(xué)展示了收縮期和舒張期某一瞬時的 兔主動脈壁面剪切應(yīng)力的空間變化（∂τ/∂x）和時間變化（∂τ/∂t）（圖 1A） ，并對主動脈弓（暴露于 OSS）和降主動脈（暴露于PSS）進(jìn)行 p62 免疫染色。結(jié)果顯示，在暴露于OSS 的主動脈弓的內(nèi)皮細(xì)胞 p62 染色顯著（圖 1B） ，而在暴露于 PSS 的降主動脈中，p62 染色幾乎不存在（圖 1C）。結(jié)果表明 剪切應(yīng)力的空間變化與 p62 染色相關(guān)，也為研究剪切應(yīng)力時間變化（PSS 與 OSS） 是否差異誘導(dǎo)自噬奠定了基礎(chǔ)。

圖1   剪切應(yīng)力的空間變化差異性增加兔主動脈中 p62 的積累。

接著，為了探究剪切應(yīng)力時間變化（PSS 與 OSS）對自噬的影響，研究將人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞分別暴露于兩種應(yīng)力中 4 小時。結(jié)果顯示，OSS 使 LC3-II/LC3-I 比值顯著升高（較靜態(tài)組增 120%，較 PSS 組增 77%），并使 p62 水平增加 37%（圖 2A），同時OSS 顯著促進(jìn)通過 Earle's 平衡鹽溶液（EBSS）誘導(dǎo)的饑餓性自噬也能增加自噬體形成 （圖2B）；而 PSS 僅輕微提高 LC3 比值（23%），對 p62 水平和自噬體形成無顯著影響（圖 2A與圖 2B）。此外，饑餓誘導(dǎo)的自噬也會增加自噬體標(biāo)記物（圖 2B）。這些結(jié)果表明 OSS 能顯著誘導(dǎo)自噬。

為了進(jìn)一步明確 OSS 對自噬流的調(diào)節(jié)，研究人員比較了在自溶酶體抑制劑巴佛洛霉素存在時的 LC3 比值和 p62 水平。結(jié)果顯示，EBSS 誘導(dǎo)自噬時 LC3 比值升高、p62 降低，而 EBSS 與巴佛洛霉素聯(lián)合處理則使兩者均進(jìn)一步升高（圖 2C）。OSS 與巴佛洛霉素聯(lián)合處理也使 LC3 比值和 p62 水平較單獨 OSS 組升高（圖 2C）。這表明 OSS 雖能通過增加 LC3-II/LC3-I 比值誘導(dǎo)自噬，但會因 p62 水平升高而損傷自噬流，導(dǎo)致自噬過程不完整。

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圖2   剪切應(yīng)力的時間變化（OSS vs. PSS ）差異性誘導(dǎo)HAECs 的自噬。

已有研究表明 OSS 可通過激活 NADPH 氧化酶和 JNK 信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物。研究人員通過轉(zhuǎn)染 MnSOD 腺病毒減少線粒體超氧化物，結(jié)果顯示，MnSOD 過表達(dá)顯著降低了 OSS 誘導(dǎo)的 LC3-II/LC3-I 比值（與靜態(tài)條件相比，p<0.05，n=4）（圖 3A）。 使用抗氧化劑 NAC、JNK 抑制劑 SP600125 處理人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，均顯著降低了 OSS 誘導(dǎo)的 LC3-II/LC3-I 比值（圖 3B、C）。這表明，OSS 通過介導(dǎo)超氧化物產(chǎn)生和 JNK 磷酸化來誘導(dǎo)自噬。

圖3   OSS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及 JNK 激活可激活自噬。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OSS 會顯著增加人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體超氧化物（mtO₂・⁻）產(chǎn)生（圖 4A）。而 EBSS 可減輕 OSS 對自噬流的抑制并減少 mtO₂・⁻產(chǎn)生（圖 4A）。雷帕霉素處理也有類似效果；反之，用 siRNA 敲低 ATG5 則會增強(qiáng)線粒體超氧化物的熒光強(qiáng)度（圖 4B）。這表明，誘導(dǎo)自噬能夠減輕 OSS 介導(dǎo)的mtO₂・⁻ 產(chǎn)生。

圖4    EBSS 激活的自噬減輕了OSS 誘導(dǎo)的mtO₂・⁻ 產(chǎn)生。

然后研究發(fā)現(xiàn)，OSS 會顯著降低線粒體呼吸（降幅 46%），EBSS 誘導(dǎo)的自噬逆轉(zhuǎn)了 OSS 介導(dǎo)的線粒體呼吸降低（圖 5A）。OSS 會顯著降低線粒體復(fù)合體 II 活性（降幅 43%），而 而 EBSS 可恢復(fù)該活性（圖 5B）。雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬也能恢復(fù) OSS 降低的復(fù)合體 II 活性。這表明，自噬的誘導(dǎo)可恢復(fù)線粒體呼吸功能。

圖5   EBSS 激活的自噬恢復(fù)了OSS 介導(dǎo)的線粒體呼吸降低。

mtDNA 因不與組蛋白結(jié)合而易受氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，OSS 可誘導(dǎo) mtDNA 損傷（表現(xiàn)為 8-OHdG 積累且與線粒體共定位）（圖 6A）。OSS 使 mtDNA 損傷增加 4.5 倍（圖 6B），而對核 DNA 損傷無顯著影響（圖 6C）。進(jìn)一步實驗顯示，過表達(dá) MnSOD、使用抗氧化劑NAC 或 JNK 抑制劑 SP600125，均能顯著減輕 OSS 誘導(dǎo)的 mtDNA 損傷（圖 7A-7C） 。這表明，OSS 通過誘導(dǎo) mtO₂・⁻產(chǎn)生和激活 JNK 信號通路來促進(jìn) mtDNA 損傷。

圖6   OSS 誘導(dǎo)線粒體 DNA損傷。

圖7   抗氧化劑和 JNK 抑制劑可逆轉(zhuǎn)OSS 誘導(dǎo)的線粒體 DNA損傷。

最后，為了在體內(nèi)研究 OSS 誘導(dǎo)的 JNK 激活和 mtDNA 損傷的空間變化，研究對新西蘭白兔的主動脈弓和降主動脈進(jìn)行免疫染色，發(fā)現(xiàn)主動脈弓中氧化 DNA 損傷標(biāo)志物 8-OHdG 和磷酸化 JNK 的染色顯著，而降主動脈中幾乎無染色（圖 8）。這表明剪切應(yīng)力的空間變化（如主動脈弓的不同彎曲部位與降主動脈之間）和時間變化（OSS 與 PSS）會差異性地誘導(dǎo)自噬和自噬流（圖 1），從而調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)（圖 6）。

圖8   剪切應(yīng)力的空間變化差異性地促進(jìn)新西蘭白兔的 DNA 損傷和 JNK 激活。

圖9   OSS 調(diào)控自噬的機(jī)制示意圖。

總之，血流剪切應(yīng)力的空間和時間變化會調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞代謝狀態(tài)，與動脈粥樣硬化病變的局灶性和偏心性相關(guān)。雖流體剪切應(yīng)力與氧化應(yīng)激的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已明確，但研究進(jìn)一步揭示了紊亂血流的新代謝作用：一是通過影響 LC3-II/LC3-I 比值促進(jìn)自噬體生成，二是通過 p62 積累損傷自噬流。同時，還闡明了 OSS 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和 JNK 信號通路在激活自噬、調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)中的作用（圖 9）。

參考文獻(xiàn)：Li R, Jen N, Wu L, Lee J, Fang K, Quigley K, Lee K, Wang S, Zhou B, Vergnes L, Chen YR, Li Z, Reue K, Ann DK, Hsiai TK. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxid Redox Signal. 2015 Nov 20;23(15):1207-19. doi: 10.1089/ars.2014.5896. Epub 2015 Jun 29. PMID: 26120766; PMCID: PMC4657520.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26120766/
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