Pipetty電動(dòng)移液器在豬藍(lán)耳病毒免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)中的應(yīng)用
方案摘要：豬繁殖與呼吸綜合征，是由病毒（PRRSV）感染豬引起的一種高度傳染性疫病，臨床表現(xiàn)為母豬繁殖系統(tǒng)障礙，斷奶仔豬消瘦、生長(zhǎng)遲緩以及死亡率增加。該病能引起豬體溫升高、呼吸困難，導(dǎo)致豬耳朵發(fā)紺，又稱藍(lán)耳病，Pipetty 電動(dòng)移液器通過(guò)高精度分液、智能化控制及高效操作，全面優(yōu)化了 IPMA 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尤其在樣本處理、免疫反應(yīng)及結(jié)果判讀中顯著提升實(shí)驗(yàn)可靠性與效率。其技術(shù)優(yōu)勢(shì)不僅滿足當(dāng)前豬藍(lán)耳病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化需求，更為未來(lái)自動(dòng)化檢測(cè)平臺(tái)的搭建提供了核心工具支持。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
豬藍(lán)耳病免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）是檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS） 的經(jīng)典血清學(xué)方法，核心用于檢測(cè)豬血清中的 PRRS 病毒特異性抗體，通過(guò)觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)變色，可判斷血清中是否存在 PRRS 抗體。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 倒置生物顯微鏡。
2、試劑和材料
① IPMA 診斷板；
② PRRSV 陽(yáng)性血清、陰性血清和 HRP-兔抗豬IgG結(jié)合物；
③ 洗滌液；
④ 血清稀釋液和顯色/底物溶液。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、稀釋血清樣本：使用Pipetty電動(dòng)移液器的連續(xù)分液功能，在空板的A排和E排各孔分別加入 180μL的血清稀釋液，其余各孔加120μL。將 20 μL被檢血清和對(duì)照血清分別加入 A 排和E排各孔（1：10 稀釋），搖動(dòng)混勻；從 A排和 E排各孔內(nèi)取 40 μL 分別加入 B排和F排孔，依次做1：40、1∶160、1∶640 稀釋。
2、設(shè)置連續(xù)分液模式，吸取上述板中稀釋血清樣本，按每孔/50μL，分別加入 IPMA 診斷板的相應(yīng)孔內(nèi)，封板后 37 ℃孵育1h，棄去液體，用 0.15 mol/mL NaC1（含 0.5%吐溫-80）洗板3次。
3、用 0.15 mol/L，NaC1（含0.5%吐溫-80）稀釋 HRP-兔抗豬 IgG 結(jié)合物為工作濃度，使用連續(xù)分液功能，按每孔50 μL，結(jié)合物稀釋液于板的孔中，封板后 37 ℃孵育1 h，洗滌3次。
4、在各孔中加入50μL顯色劑/底物溶液（AEC-H202），在 18 ℃~22 ℃室溫下作用至少 30 min，棄去液體，加入 50 μL 0.05 mol/L 醋酸鈉溶液。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件：將 IPMA 診斷板置于倒置生物顯微鏡下觀察。陽(yáng)性血清對(duì)照孔細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深紅色的特異性染色，陰性血清對(duì)照孔細(xì)胞質(zhì)不被染色。
2、被檢血清樣本孔 30%~50%的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深紅色，判定為免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)陽(yáng)性（IPMA+）：細(xì)胞質(zhì)未被染色，判定為免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)陰性（IPMA一）。與陽(yáng)性血清對(duì)照相比，若整孔細(xì)胞被染色，則視為血清樣本的非特異性反應(yīng)。血清滴度以 50%以上的孔染色的最高稀釋度的倒數(shù)表示。血清樣本的滴度<10 判定為陰性；血清樣本的滴度為 10或 40判定為弱陽(yáng)性，非特異性染色常在此范圍內(nèi)：血清樣本的滴度≥160判定為陽(yáng)性。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
豬藍(lán)耳病免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）是檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS） 的經(jīng)典血清學(xué)方法，核心用于檢測(cè)豬血清中的 PRRS 病毒特異性抗體，通過(guò)觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)變色，可判斷血清中是否存在 PRRS 抗體。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 倒置生物顯微鏡。
2、試劑和材料
① IPMA 診斷板；
② PRRSV 陽(yáng)性血清、陰性血清和 HRP-兔抗豬IgG結(jié)合物；
③ 洗滌液；
④ 血清稀釋液和顯色/底物溶液。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、稀釋血清樣本：使用Pipetty電動(dòng)移液器的連續(xù)分液功能，在空板的A排和E排各孔分別加入 180μL的血清稀釋液，其余各孔加120μL。將 20 μL被檢血清和對(duì)照血清分別加入 A 排和E排各孔（1：10 稀釋），搖動(dòng)混勻；從 A排和 E排各孔內(nèi)取 40 μL 分別加入 B排和F排孔，依次做1：40、1∶160、1∶640 稀釋。
2、設(shè)置連續(xù)分液模式，吸取上述板中稀釋血清樣本，按每孔/50μL，分別加入 IPMA 診斷板的相應(yīng)孔內(nèi)，封板后 37 ℃孵育1h，棄去液體，用 0.15 mol/mL NaC1（含 0.5%吐溫-80）洗板3次。
3、用 0.15 mol/L，NaC1（含0.5%吐溫-80）稀釋 HRP-兔抗豬 IgG 結(jié)合物為工作濃度，使用連續(xù)分液功能，按每孔50 μL，結(jié)合物稀釋液于板的孔中，封板后 37 ℃孵育1 h，洗滌3次。
4、在各孔中加入50μL顯色劑/底物溶液（AEC-H202），在 18 ℃~22 ℃室溫下作用至少 30 min，棄去液體，加入 50 μL 0.05 mol/L 醋酸鈉溶液。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件：將 IPMA 診斷板置于倒置生物顯微鏡下觀察。陽(yáng)性血清對(duì)照孔細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深紅色的特異性染色，陰性血清對(duì)照孔細(xì)胞質(zhì)不被染色。
2、被檢血清樣本孔 30%~50%的細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深紅色，判定為免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)陽(yáng)性（IPMA+）：細(xì)胞質(zhì)未被染色，判定為免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)陰性（IPMA一）。與陽(yáng)性血清對(duì)照相比，若整孔細(xì)胞被染色，則視為血清樣本的非特異性反應(yīng)。血清滴度以 50%以上的孔染色的最高稀釋度的倒數(shù)表示。血清樣本的滴度<10 判定為陰性；血清樣本的滴度為 10或 40判定為弱陽(yáng)性，非特異性染色常在此范圍內(nèi)：血清樣本的滴度≥160判定為陽(yáng)性。
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