基因治療的制造之道：生物技術的新突破

文章作者： 彪彪 文章來源：抗體圈

摘要：將遺傳物質轉移到宿主患者體內以獲得治療益處的概念已經有超過半個世紀的歷史。然而，直到2017年，隨著美國FDA批準首個CAR-T細胞療法，隨后歐盟也批準了這一療法，這一概念才成為臨床現(xiàn)實。自首個產品獲批以來，已有更多基因療法上市，而且處于晚期臨床試驗階段的產品數(shù)量表明，基因療法可能成為生物制藥行業(yè)增長最快的領域之一。對于任何生物制藥產品的商業(yè)成功來說，能夠經濟地大規(guī)模生產治療產品以滿足市場需求是一個關鍵因素。迄今為止，制造過程已經能夠在必要的規(guī)模上生產滿足臨床研究需求的基因治療病毒載體。然而，為了滿足商業(yè)需求，尤其是對于治療患者群體龐大的疾病的療法，當前的生物制造過程需要擴大規(guī)模和優(yōu)化。

1.介紹

基因轉移至宿主細胞以替代缺失或有缺陷的基因，并且轉移的基因表達能夠提供治療益處的概念最早由西奧多·弗里德曼（Theodore Friedmann）提出，第一個臨床實驗是在1970年進行的�；�因治療最初被設想為一種治療遺傳病的方法。然而，也構想了替代策略來治療其他具有遺傳成分的疾病。當前的基因治療模型包括：（i）基因替代，傳遞一個功能性基因以替代一個不起作用的基因；（ii）基因沉默，使一個對細胞有毒的突變基因失活；（iii）基因添加，過度表達一個“外來”或外源基因以影響細胞功能；以及（iv）基因編輯，對患者基因組中的基因進行永久性操作。

在過去50年中，基因治療經歷了過山車般的發(fā)展，許多進步之后伴隨著挫折。1980年，隨著重組DNA的出現(xiàn)，科學家們證明了可以在體外用rDNA轉化小鼠骨髓細胞，并將轉化后的細胞注射到經過輻射的小鼠體內，產生主導的骨髓群體。同樣的技術也被用來轉化兩名患有遺傳性疾病β-地中海貧血患者的骨髓細胞，使用重組人類β-珠蛋白基因。第一個涉及人類患者的試驗使用了逆轉錄病毒介導的腺苷脫氨酶（ADA）基因轉移到兩名患有嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的兒童的T細胞中�？傮w而言，結果是肯定的，并提供了概念驗證，即基因治療對某些患者是一種安全有效的治療方法。然而，1999年杰西·格爾辛格（Jesse Gelsinger），一名18歲患有較輕微的氮代謝障礙鳥氨酸轉氨甲酰酶（OT）缺乏癥的青年，在參加基因治療試驗時因腺病毒載體相關毒性死亡，這表明了與基因轉移相關的科學復雜性。在五名患有嚴重聯(lián)合免疫缺陷-X1（SCID-X1）的患者體外轉染CD34+細胞后發(fā)展成白血病，其中一人死亡，進一步引發(fā)了擔憂，這些細胞被轉染了編碼γ鏈細胞因子受體亞單位的小鼠逆轉錄病毒載體。這項研究包括了20名患者，基因治療確實為兩名患者提供了完全的疾病表型糾正。中國的監(jiān)管機構在2003年批準了世界上第一個商業(yè)化的基因治療產品Gendicine，用于治療頭頸鱗狀細胞癌，這是一種皮膚癌。Gendicine是一種經過工程改造的病毒，攜帶有制造抗腫瘤蛋白的基因指令。這種產品在中國以外沒有獲得批準，直到2012年歐洲才批準了第一個基因治療產品Glybera。Glybera利用一種重組腺相關病毒（AAV），可用于治療家族性脂蛋白脂肪酶缺乏癥（LPLD）。然而，由于LPLD是一種罕見疾病，患者數(shù)量極少，這種藥物無利可圖。因此，制造商拒絕更新市場授權，Glybera在2017年退出市場。2017年8月30日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準了tisagenlecleucel（Kymriah），這是第一個獲得FDA批準的基因治療產品。Kymriah是一種針對CD19的嵌合抗原受體（CAR）T細胞免疫療法，用于治療年齡≤25歲的B細胞前體急性淋巴細胞性白血�。ˋLL）患者，這些患者對治療有抗性，處于第二次或更晚的復發(fā)狀態(tài)。Kymriah隨后在2018年獲得歐盟批準。表14.1提供了截至2022年12月FDA批準的所有基因治療產品的列表。

轉染宿主細胞的三種通用協(xié)議（如圖14.1所示）：體外、體內和原位。在體外基因轉移中，患者的細胞被分離并用治療基因轉染。轉染的細胞在被重新輸回患者之前進行擴增。這種方法已有效地用于兒童白血病的CAR-T細胞治療。雖然體外基因治療對治療血液疾病有效，但體內基因治療對治療腦部、脊髓或肝臟疾病更有效。體內基因治療直接將基因載體注入宿主，通過循環(huán)血液或腦脊液，在全身范圍內轉染目標細胞。主要使用兩種類型的病毒載體：腺病毒（AdV）載體和腺相關病毒（AAV）載體。與體內基因治療類似，原位基因治療直接向宿主患者引入載體；然而，主要區(qū)別在于載體是被施用于患者的特定器官或區(qū)域，而不是靜脈注射。

圖 14.1 傳遞治療基因和轉染宿主細胞的方法。

與體內基因治療相比，這種方法具有幾個優(yōu)點，比如減少潛在的副作用、降低載體劑量的需求，以及因此而降低的成本。任何基因治療策略成功的關鍵在于擁有一個能夠作為安全且高效基因傳遞工具的載體。治療性基因可以通過病毒載體或非病毒載體傳遞給細胞。研究最多的非病毒載體是聚合物、脂質、無機顆�；虿煌�類型的組合。與病毒載體相比，非病毒載體在細胞毒性、免疫原性和致突變性方面較低。然而，非病毒載體并不具備理想的特性，并且面臨諸如基因轉移效率、特異性、基因表達持續(xù)時間和安全性等關鍵挑戰(zhàn)。目前FDA批準的基因治療中沒有使用非病毒載體。相比之下，病毒具有復雜而精確的結構特征，通過自然進化調整，以高效轉染特定的宿主細胞或組織。目前FDA批準的基因治療中使用幾種病毒作為基因傳遞載體，包括逆轉錄病毒（由小鼠白血病病毒（MLV）衍生的γ-逆轉錄病毒載體和主要來自HIV-1的慢病毒載體（LV））、腺病毒、腺相關病毒和單純皰疹病毒1型。這些病毒載體的典型特征總結在表14.2中。病毒載體的主要限制是非優(yōu)化過程的產量相對較低。要使病毒基因治療在臨床和商業(yè)上取得成功，必須有能夠高效和經濟地生產病毒的生物制造系統(tǒng)，以滿足市場需求。

2.慢病毒

慢病毒是逆轉錄病毒科的一個亞科。與其他病毒相比，逆轉錄病毒具有獨特的特點，它們包含單鏈RNA，在宿主細胞感染期間會被逆轉錄。與早期臨床試驗中作為潛在基因治療載體被廣泛研究的腫瘤病毒亞科不同，慢病毒亞科能夠感染靜止和后有絲分裂細胞，被歸類為復雜逆轉錄病毒。逆轉錄病毒的衣殼是一個包膜蛋白殼，包含病毒基因組，直徑為80-100納米。圍繞衣殼的包膜結構是一個脂質雙層，包含病毒編碼的表面糖蛋白和源自宿主細胞的跨膜糖蛋白。慢病毒亞科的基因組是線性的、非分段的、單鏈RNA，長度為7-12 kb。簡單逆轉錄病毒的基因組，如γ-逆轉錄病毒，包含三個主要編碼段和一個小型編碼域。主要段包含三個基因——gag、pol和env——它們編碼對病毒整合、復制和包裝重要的蛋白。小型編碼域包含pro基因，編碼病毒蛋白酶。復雜逆轉錄病毒，如慢病毒，的基因組包含與簡單逆轉錄病毒相同的基因（gag、pol和env），但還包含六個額外的基因——兩個調節(jié)基因和四個輔助基因——它們編碼對病毒復制、結合、感染和釋放重要的蛋白。表14.3概述了這六個基因及其表達蛋白的功能。

逆轉錄病毒通過外層包膜上的糖蛋白與特定細胞受體之間的相互作用感染細胞。一旦病毒與細胞表面受體結合，就會發(fā)生一系列事件，導致病毒顆粒被納入細胞脂質雙層，隨后病毒遺傳物質被卸入細胞質。然而，慢病毒的生命周期中發(fā)生了一些獨特的事件，這解釋了它們能夠感染非分裂細胞的能力。首先，基因表達發(fā)生在兩個獨立的階段，即早期和晚期，這兩個階段由rev蛋白的結合分隔。其次，慢病毒通過vpr基因表達的蛋白感染非分裂細胞。最后，僅在復雜逆轉錄病毒中發(fā)現(xiàn)的tat基因對HIV-1的復制至關重要。

2.1.慢病毒載體在基因治療中的應用

作為基因治療載體研究最多的慢病毒（LV）是人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。安全性至關重要，由于HIV-1對人類的致病性，LV載體系統(tǒng)被設計為復制缺陷型。幾乎所有的臨床和研究工作，包括用于生產CAR T細胞的慢病毒載體，都基于第三代包裝系統(tǒng)和自失活（SIN）配置，自第三代慢病毒載體開發(fā)以來，最先進的慢病毒載體的設計并沒有發(fā)生戲劇性的變化。第三代載體基于一個四質粒系統(tǒng)，包括一個基因轉移載體（TV質粒）和三個輔助質粒，如圖14.2所示。TV質粒是轉移到目標細胞的唯一遺傳物質，由包含轉基因表達盒的LV骨干組成，其兩側是需要用于包裝、逆轉錄和整合的順式作用元素。所有輔助基因，nef、vpr、vpu和Vif，都被移除，因為它們是不必要的，調節(jié)tat基因被消除。復制所需的rev基因以轉錄方式提供，以創(chuàng)建一個條件包裝平臺。載體被賦予一個由非常特定的糖蛋白組成的包膜結構，即狂犬病病毒糖蛋白（VSV-G），這使得載體具有高親和力，能夠感染多種細胞類型。通過刪除包含TATA盒和轉錄因子結合位點的3′-LTR的一部分，安全性得到進一步增強。因此，載體包裝系統(tǒng)變得自失活（SIN）。

圖 14.2 第三代不依賴Tat的慢病毒載體系統(tǒng)的示意圖。所示的SIN轉移載體包含cPPT以實現(xiàn)有效的核輸入，并使用MSCV LTR啟動子（MU3）作為內部啟動子來驅動轉基因的表達，以及WPRE（W）元件以實現(xiàn)高水平的轉基因表達。三個包裝構建編碼HIV-1的gag-pol和rev蛋白以及VSV-g包膜糖蛋白。

2.2.生產細胞系

大多數(shù)當前的LV載體生產系統(tǒng)涉及對HEK293或HEK293T細胞的瞬時轉染。這些細胞被轉染含有gag-pol、env、rev和TV質粒的四個質粒。與HEK293細胞系相比，HEK293T細胞系產生更高的病毒滴度，因此是首選的生產平臺。HEK293細胞系和HEK293T細胞系之間的唯一區(qū)別是后者攜帶腫瘤病毒SV40大T抗原。表達SV40 T-抗原的細胞中引發(fā)細胞生長和轉染效率增加的機制尚不清楚，但這一現(xiàn)象也在CV-1（SV40 T-抗原陰性）和COS-1（SV40 T-抗原陽性）細胞之間得到證實。然而，SV40 T-抗原是腫瘤病毒，因此帶來了一些安全問題。使用四質粒轉染方法在病毒滴度上的批次間變異性也是一個重大挑戰(zhàn)。第一個成功的穩(wěn)定生產細胞系之一是STAR包裝細胞系。該細胞系是通過將HEK293T細胞與編碼密碼子優(yōu)化的gag-pol基因的γ-逆轉錄病毒載體共轉染，隨后引入HIV-1調節(jié)蛋白Tat和Rev的基因、一個包膜蛋白和一個HIV-1 LV載體。優(yōu)化轉染載體基因組表達盒的結構，導致了SIN LV載體生產細胞系的開發(fā)。與瞬時轉染相比，穩(wěn)定生產細胞系具有幾個優(yōu)點，包括批次間的可重復性、可擴展性和成本�；�于HIV-1的LV載體開發(fā)穩(wěn)定生產細胞系已被證明是具有挑戰(zhàn)性的。包裝基因和與HIV-1基礎LV載體發(fā)生的基因沉默在長期培養(yǎng)期間會導致細胞毒性。為克服這一限制，采用了兩種不同的策略。第一種策略使用四環(huán)素誘導系統(tǒng)來控制VSV-G和gal-pol基因的表達。替代誘導型穩(wěn)定細胞系的策略是創(chuàng)建組成型包裝細胞系。這些已經為一些比VSV-G毒性小的包膜蛋白開發(fā)出來，如cocal和RD114-TR。

2.3.慢病毒載體生產

慢病毒載體在幾種FDA批準的基因治療中得到應用。如表14.1所示，這些治療都采用體外基因轉移，并且劑量要求高達10^9個CAR-T陽性細胞。根據FDA指南，CAR-T陽性細胞被視為最終治療產品（在歐盟也稱為藥品），而LV載體被視為關鍵原材料。盡管最終的細胞產品是自體的，并且必須為每個患者單獨生產，但LV載體可以大量生產，并在-80°C下冷凍保存數(shù)年。

慢病毒載體的商業(yè)規(guī)模生產可以通過擴展（即增加輔助生產系統(tǒng)）支持錨定依賴細胞的小規(guī)模系統(tǒng)，或者通過擴展支持懸浮細胞擴增的系統(tǒng)來實現(xiàn)。目前，大多數(shù)大規(guī)模生產依賴于錨定依賴細胞。由于HEK293細胞是弱錨定依賴的，滾筒瓶培養(yǎng)并不普遍。生產是在多托盤系統(tǒng)的平行培養(yǎng)中進行的——無論是細胞工廠還是細胞堆疊。首選系統(tǒng)是10堆疊系統(tǒng)。從理論上講，可以使用40堆疊系統(tǒng)，但這些系統(tǒng)由于其大小和重量而存在處理問題。此外，堆疊之間的質量傳遞可能不均勻，這導致溶解氧水平的變化。LV載體收獲次數(shù)可以從一次最終收獲到最多三次收獲，從12-24個10堆疊細胞工廠設備中生產出20-52升。使用細胞工廠生產LV載體有一些缺點，即收獲窗口有限、勞動強度大、在開放式系統(tǒng)中保持無菌以及需要大量的孵化器空間。為此，研究人員已經研究了固定床系統(tǒng)、中空纖維生物反應器和裝有Fibra-cel圓盤的Wave生物反應器，細胞被固定在圓盤上。表14.4比較了在LV載體生產中使用的不同的生產系統(tǒng)。

由于錨定依賴細胞在可擴展性上的固有限制，HEK-293 T培養(yǎng)物可以適應無血清、懸浮培養(yǎng)，用于慢病毒載體生產，并在傳統(tǒng)的攪拌罐生物反應器中使用。無血清懸浮培養(yǎng)的主要缺點是細胞密度較低，與錨定依賴細胞培養(yǎng)系統(tǒng)相比，病毒滴度降低。使用懸浮培養(yǎng)的初始研究表明，病毒滴度在10^6 TU/mL及以下。通過在連續(xù)模式下而不是批量模式下運行生物反應器，LV載體的累積產量可以增加高達15倍，滴度達到3.2×10^7 TU/mL，與錨定依賴細胞培養(yǎng)系統(tǒng)相當。最近的研究通過在懸浮介質中逐漸適應，報告了10^8 TU/mL的LV載體滴度。在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)細胞時，另一個考慮因素是從上清液中分離細胞和病毒。連續(xù)培養(yǎng)利用了聲波細胞過濾技術和切向流深層過濾（TFDF），這些技術能夠在生物反應器內保留細胞。累積功能產量達到3.3×10^11和3.9×10^11轉導單位；前者在6天的LV生產中，使用了16.3升的灌注介質，后者在4天內使用了16升。批量培養(yǎng)依賴于收獲后使用離心和過濾來去除細胞。

3.腺病毒

腺病毒（Ad）最初于1953年在人類脂肪組織中被鑒定出來。有六個物種（A-F）感染人類，進一步細分為五十多種感染性血清型。腺病毒衣殼的球形旋鈕結構對coxsackie/腺病毒受體（CAR）具有高親和力，該受體可在人體各種細胞中找到。因此，人類腺病毒被認為是所有急性呼吸道感染的5-10%的原因。腺病毒的傳染性，以及它們利用細胞機制合成病毒mRNA和蛋白的能力，導致腺病毒載體在大約50%的當前臨床試驗中得到使用。

腺病毒是一種無包膜病毒。基因組是線性的、雙鏈DNA（dsDNA），長度在26到40 kb之間[73]。這種線性形式在病毒衣殼內被組織成緊湊的類似核小體的結構，并且在每個DNA鏈的末端具有類似發(fā)夾的倒置末端重復（ITR）序列。ITRs的長度不同，可以在末端之間有30到371 bp。如圖14.3所示，病毒基因組包含兩個主要的轉錄區(qū)域，稱為早期區(qū)域和晚期區(qū)域�；�因組的早期區(qū)域包含四個重要的轉錄單元（E1, E2, E3和E4），這些單元在細胞感染后被激活。此外，基因組包含兩個延遲早期轉錄單元（IX和IVa2）和一個主要的晚期（ML）轉錄單元，通過翻譯后處理（從L1到L5）處理生成晚期區(qū)域mRNAs。

圖 14.3 腺病毒5型(Ad5)基因組地圖以及不同代的腺病毒載體。

3.1.腺病毒載體在基因治療中的應用

第一代腺病毒載體的基因組中E1A/E1B區(qū)域被多達4.5 kb的DNA轉基因盒替換。E1A蛋白是病毒復制所必需的。從病毒基因組中刪除這些基因，因此需要開發(fā)互補的生產細胞系，這些細胞系提供了這些基因，如293, 911, N52.E6或PER.C6。E3區(qū)域對病毒復制并非必需，也可以被刪除以創(chuàng)造額外的空間用于轉基因盒。這些消除允許向載體中插入多達8.3 kb的DNA。第一代腺病毒載體受到兩個限制的困擾：（i）腺病毒蛋白的新表達可以激活宿主免疫反應，導致清除病毒感染的細胞；（ii）如果在腺病毒載體和生產細胞的工程E1區(qū)域之間發(fā)生自發(fā)重組，可以在基因擴增期間產生具有復制能力的腺病毒。

除了刪除E1和E3基因外，第二代腺病毒載體還刪除了E2和E4基因。刪除這些額外的基因允許插入多達14 kb的DNA轉基因盒。然而，E2和E4區(qū)域包含轉錄增加病毒編碼基因表達的蛋白的基因。因此，與第一代腺病毒載體相比，第二代腺病毒載體中治療基因的表達較低。與第一代載體一樣，細胞毒性T細胞攻擊并消除體內轉導的第二代腺病毒載體的細胞，限制了治療基因表達的持續(xù)時間。

第三代腺病毒載體，也稱為剝離或無病毒載體，除了ITR和包裝區(qū)域外，所有腺病毒DNA都被移除。這允許向載體中插入36 kb的DNA。復制需要包裝細胞與輔助載體（HV）共感染，輔助載體能夠在轉錄中產生所有必要的蛋白。剝離的腺病毒載體在表達HV和Cre重組酶的HEK293生產細胞中生產。HV蛋白允許剝離載體的復制和包裝。工程化的Cre確保通過Cre介導的loxP位點重組，HV基因組包裝信號被切除，并且只有剝離的腺病毒基因組可以被包裝。

3.2.腺病毒載體生產

幾個上游過程參數(shù)影響腺病毒載體生產的數(shù)量和質量。這些包括生產細胞系、病毒感染參數(shù)、細胞生長條件和操作模式。這些參數(shù)可以相互影響，需要一個全面的、系統(tǒng)級的方法來優(yōu)化生物制造過程。

第一代腺病毒載體的生產通常使用HEK293和PER.C6細胞。HEK293細胞系是通過將人類胚胎腎（HEK）細胞與切碎的人類Ad5 DNA共轉染而產生的，其中核苷酸1-4344，包括E1區(qū)域，被整合到19號染色體上。這些細胞非常多功能，可以在懸浮或貼壁狀態(tài)下培養(yǎng)，并且可以使用無血清或含血清的培養(yǎng)基。據預測，HEK293細胞的懸浮培養(yǎng)可以達到高達10,000升的規(guī)模，病毒產量在10^9到10^10 VP/mL之間。

HEK293細胞系的一個嚴重缺點是在生產過程中由于同源重組事件頻繁產生具有復制能力的腺病毒（RCA）。PER.C6細胞系的開發(fā)旨在減少生產過程中RCA出現(xiàn)的風險。PER.C6細胞系包含Ad5 E1A和E1B編碼序列（核苷酸459-3510），在人類磷酸甘油酸激酶（PGK）啟動子的控制下。通過將細胞與沒有序列重疊的腺病毒載體結合，克服了RCA的產生。PER.C6細胞可以在有無血清的懸浮培養(yǎng)中生長，已成為行業(yè)標準。

第二代腺病毒載體，缺乏E1、E2和E4區(qū)域，可以與源自HeLa和Vero細胞的跨補細胞系一起生產。已經開發(fā)了細胞系來生產E2缺陷的腺病毒載體和E4缺陷的腺病毒載體�；�于HEK293、911和E1修飾的A549細胞的細胞系也已被生成，以允許第二代腺病毒載體的傳播。

第三代或無病毒載體，除了對病毒DNA復制和包裝所必需的順式作用序列外，所有基因都被移除。由于需要一個適當?shù)纳�產細胞系來提供所有必要的病毒元素，載體生產變得復雜。一些腺病毒蛋白的細胞毒性可能是創(chuàng)建補充這些載體的細胞系工作失敗的最可能原因。因此，有必要提供輔助腺病毒載體（HV），它提供病毒粒子所需的包裝蛋白。生產細胞系源自293細胞，并表達Cre重組酶，而HV被修飾為包含包裝位點周圍的loxP位點。在293Cre細胞中，包裝信號被有效地切除，防止輔助病毒基因組被包裝。然而，切除效率并不完美，與HV的污染是一個嚴重的問題，報告的水平在0.01-1%之間。

腺病毒載體的滴度受到多種因素的影響，包括感染的多重性（MOI）、收獲時間（TOH）和感染時的細胞濃度（CCI）。一旦生產細胞被腺病毒載體接種，感染可以迅速發(fā)生，大約需要48小時完成一個感染周期。因此，制造過程被配置為單輪感染周期，MOI>1以確保所有細胞都被感染。應為每個系統(tǒng)確定最佳MOI；然而，Ad5培養(yǎng)過程的典型值范圍是每個細胞10到200個病毒顆粒，結果是放大比率>200。

可以在攪拌罐生物反應器中培養(yǎng)適應懸浮培養(yǎng)的Per.C6和293細胞。當細胞在批量培養(yǎng)中生長時，病毒生產的最佳細胞密度約為5×10^5細胞/mL，比可能的理論最大細胞密度低一個數(shù)量級。這被稱為“細胞密度效應”。細胞代謝受到營養(yǎng)耗盡和代謝物積累的阻礙，使細胞無法在高密度下支持病毒生產。在感染時交換介質可以減少細胞密度效應，因為這補充了底物并去除了代謝物。當使用連續(xù)培養(yǎng)模式時，密度超過5×10^6細胞/mL，規(guī)模從3到20升。通過替換至少90%的介質，可以實現(xiàn)最佳病毒生產，每毫升1×10^6細胞。通過優(yōu)化生物反應器中的物理化學條件可以顯著提高病毒滴度。溫度、pH值、溶解氧（DO）和部分CO2壓力（pCO2）都已被證明是細胞生長、代謝和腺病毒生產的重要參數(shù)。

4.腺相關病毒

腺相關病毒（AAV）是一種小的、自然復制缺陷病毒，最初在1965年作為腺病毒的共感染因子被發(fā)現(xiàn)。為了在宿主細胞核內復制，AAV需要腺病毒或皰疹病毒等輔助病毒的幫助，或某種形式的基因毒性應激。有11種不同的AAV血清型和100多種AAV變體，盡管血清型AAV6幾乎與AAV1相同，AAV10和AAV11的表征不是很好。每種血清型都有自己的特征衣殼，對某些宿主細胞受體有特殊的親和力，允許它被用來針對各種組織類型。AAV基因組由單鏈DNA組成，大約5 kb長�；�因組缺乏病毒復制和表達自身基因組所需的基本基因。腺病毒從E1、E2a、E4和VA RNA基因提供這些功能。AAV基因組包含四個已知的開放閱讀框（ORF），四個復制基因（rep）包含在第一個ORF中，編碼三個病毒衣殼蛋白的cap基因位于第二個ORF，第三個和第四個ORF上的亞基因組mRNA被轉錄以產生組裝激活蛋白（AAP）�；�因組的兩端都由倒置末端重復（ITR）序列所包圍，這些序列作為復制的自我啟動結構，并提供Rep介導的包裝信號。

4.1.腺相關病毒載體在基因治療中的應用

從AAV制作載體的過程始于刪除編碼Rep和Cap蛋白的基因。這種刪除提供了大約5 kb的包裝空間，用于外來DNA。新的DNA被插入到只包含ITRs的“剝離”病毒中。ITRs包含在輔助病毒存在下復制和包裝所需的所有順式作用元素。Rep和Cap蛋白和所有必要的腺病毒輔助基因在一到兩個質粒上表達。從質粒上表達Ad基因消除了與野生型腺病毒共感染的需要。

4.2.腺相關病毒載體生產

生產AAV載體的三種不同生產系統(tǒng)。傳統(tǒng)方法利用哺乳動物細胞的瞬時轉染，最常見的是HEK293細胞。細胞被共轉染三種質粒，以等摩爾比包含rAAV載體（即，由ITRs包圍的轉基因）、rep和cap基因，以及腺病毒輔助基因E1、E2a、E4和VA RNA。存在該協(xié)議的變體，使用雙質粒系統(tǒng)，將包裝和輔助功能合并到單個質粒上，或四質粒系統(tǒng)將rep和cap基因分別放置在不同的質粒上。通過添加酵母提取物（酵母素、Trypton N1或兩者）可以增強rAAV的生產，這可以增加2.8至3.4倍的生產產量。

無血清懸浮培養(yǎng)已成功用于通過瞬時轉染生產rAAV載體。研究表明，可以使用20升WAVE生物反應器成功生產rAAV載體，病毒產量為10^14 VG/L。該系統(tǒng)可能被擴大到100升，這對于涉及相對較低劑量的計劃和LCA2等罕見疾病適應癥是足夠的。然而，對于成功的臨床計劃，特別是進入后期臨床試驗的，以及針對患者數(shù)量更多和/或每個患者需要更高載體劑量的疾病應用，預計需要增加一個到兩個數(shù)量級的生產能力，以滿足基因治療可能針對的不斷增加的疾病適應癥的數(shù)量。通過增加生產細胞的比例可以實現(xiàn)載體滴度的增加。盡管獲得了高轉染效率和名義載體產量，研究表明只有5%-10%的細胞似乎能產生可測量水平的組裝AAV衣殼。

作為復雜瞬時轉染方法的替代方案，可以降低成本的是開發(fā)穩(wěn)定生產細胞系。這些細胞將病毒和貨物基因整合到細胞中，消除了瞬時轉染的需要，并消除了批次間差異。已從A549細胞和HeLa細胞開發(fā)生產細胞系。包裝細胞包含包含cap、rep和由ITR序列包圍的轉基因盒以及可選擇標記基因的質粒。通過感染提供輔助病毒蛋白的復制能力Ad來啟動AAV生產。生產細胞系已適應無血清懸浮培養(yǎng)，并可在生物反應器中培養(yǎng)，產量為每15升規(guī)模的10^4病毒顆粒/細胞，有潛力擴大到500升。其他研究表明，可以在250升攪拌罐反應器中從生產細胞中生產rAAV，沒有預見到擴大到商業(yè)規(guī)模2000升生物反應器或更大的障礙。

桿狀病毒表達載體系統(tǒng)（BEVS）是另一個已被成功用于生產rAAV載體的平臺。使用BEVS的主要優(yōu)點是不需要腺病毒輔助病毒。第一代BEVS需要將三桿狀病毒表達載體（BEVs）共感染S. frugiperda（Sf9）細胞，每個載體提供AAV生成的三個基本基因（rep：Bac-Rep，cap：Bac-Cap，和ITR包圍的感興趣基因：Bac-ITR-GOI）。第一代BEVS受到BEVs的遺傳不穩(wěn)定性的困擾，導致AAV產量和無法生產其他血清型的功能性AAV載體的能力下降。因此，它們沒有得到廣泛使用。通過開發(fā)依賴于一個或兩個BEVs的系統(tǒng)，即One-Bac/Mono-Bac和Two-Bac，克服了這些限制。Mono-Bac系統(tǒng)要求Sf9細胞感染帶有所有三個基本AAV基因的單個BEV。這是一種與One-Bac1.0協(xié)議不同的方法，該協(xié)議利用桿狀病毒（BV）在穩(wěn)定的Sf9包裝細胞中誘導rep2（AAV2 rep）和capX（X = 感興趣的血清型）基因。細胞被感染帶有ITR包圍的轉基因盒的單個桿狀病毒載體。由BEV編碼的即刻-早期轉錄調節(jié)因子1（IE-1）介導的表達增強，從整合的居民基因的擴增和表達中誘導結果。One-Bac 1.0系統(tǒng)生產的AAV2載體顆粒的細胞特異性產量比Three-Bac高出十倍[139]。Two-Bac系統(tǒng)使用一個包含rep和cap表達盒的單個BEV（Bac-Rep-Cap或Bac-In-RepCap），因此現(xiàn)在只需要共感染兩個桿狀病毒。這種方法可以從懸浮培養(yǎng)的重組桿狀病毒感染的昆蟲細胞中每細胞產生7×10^4純化rAAV顆粒。

5.未來方向和挑戰(zhàn)

近年來，獲批的基因療法數(shù)量呈指數(shù)級增長，指標表明我們將繼續(xù)看到更多產品成功完成臨床試驗并上市。慢病毒和腺相關病毒是未來基因療法研究中最可行的載體選擇，因為它們的不良反應有限且免疫原性特征良好。盡管基因療法最近取得了成功，但一些生物制造挑戰(zhàn)仍然存在。迄今為止的許多研究都集中在優(yōu)化病毒載體的設計和高效的生產者及包裝細胞系統(tǒng)上。未來的研究需要關注能夠有效監(jiān)控和控制影響關鍵質量屬性（CQA）的關鍵過程參數(shù)（CPP）的過程分析技術（PAT），從而提高最終產品的一致性并優(yōu)化生物過程生產方法。國家細胞制造聯(lián)盟（NCMC）——一個由行業(yè)、政府、臨床和學術領袖組成的公私合營聯(lián)盟——在2016年國家路線圖（以及隨后的2017年和2019年更新）中確定了多個核心挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)涵蓋了過程監(jiān)控和控制、細胞處理和自動化、供應鏈和運輸物流以及勞動力發(fā)展，必須在國家層面解決，以實現(xiàn)細胞和基因制造的未來。在確定的核心挑戰(zhàn)中包括：（i）缺乏足夠的生物加工模型來預測制造條件和材料對細胞行為的影響；（ii）缺乏足夠的替代標記物來理解細胞關鍵質量屬性（CQAs）；（iii）缺乏足夠的過程分析技術（PAT）和檢測細胞特性的檢測方法。這些挑戰(zhàn)——是行業(yè)、學術和政府利益相關者確定的最關鍵研究和發(fā)展領域——需要在人工智能（AI）（包括機器學習理論和自動化機器人學及控制學）、數(shù)據分析和預測建模方面具有顯著的技能。過程控制需要超越傳統(tǒng)的物理化學過程控制參數(shù)（pH、溶解O2和溫度），并納入組學、實時細胞代謝物分析以及內源性因素、表面標記物和基因表達的非破壞性測量。新的PAT將闡明哪些制造或過程變量可以產生具有適當CQAs的一致且可復制的產品。這反過來，又可以導致基于質量的設計（QbD）制造過程，從而提高大規(guī)模、可復制、低成本生產高質量和安全基因療法的能力。