心血管疾�。–VD）在全球范圍內(nèi)造成的死亡遠(yuǎn)超癌癥。動(dòng)脈狀硬化（AS）作為一種慢性炎癥性疾病，是多種CVD的共性病理基礎(chǔ)。靶向IL-1β的單克隆抗體藥物Canakinumab的臨床試驗(yàn)（CANTOS）首次證實(shí)了AS抗炎治療以及干預(yù)NLRP3炎癥小體激活作為治療手段的可行性。血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）激活是AS發(fā)生的使動(dòng)因素，通過(guò)介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附和泡沫細(xì)胞的形成等參與了AS進(jìn)程，但其機(jī)制尚未闡明。糖酵解（Glycolysis）過(guò)程在內(nèi)皮多種病理狀態(tài)下功能實(shí)現(xiàn)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但其對(duì)NLRP3炎癥小體及AS發(fā)生發(fā)展的作用和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

2024年4月17日，廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心血管平臺(tái)徐益鳴教授團(tuán)隊(duì)在Cardiovascular Research（醫(yī)學(xué)1區(qū)，IF=10.9）上發(fā)表了題為“Endothelial nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome regulation in atherosclerosis”的研究論文，揭示了內(nèi)皮細(xì)胞中PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解對(duì)NLRP3炎癥小體激活的全新調(diào)控通路及其在AS進(jìn)程中的關(guān)鍵作用，為抗AS治療提供了全新的代謝干預(yù)靶點(diǎn)。該論文的通訊作者為徐益鳴教授，第一作者為廣州醫(yī)科大學(xué)博士生郭帥和復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院博士生王立濤。
 

圖片來(lái)源：《Cardiovascular Research》
（https://doi.org/10.1093/cvr/cvae071）

研究材料
在此項(xiàng)目中，研究人員構(gòu)建了Apoe^-/-背景的內(nèi)皮特異性PFKFB3敲除小鼠模型（Pfkfb3^VEC-KO）探究?jī)?nèi)皮PFKFB3對(duì)NLRP3炎癥小體激活及AS進(jìn)程的調(diào)控作用。隨后使用AAV病毒（由賽業(yè)生物提供）實(shí)現(xiàn)了在內(nèi)皮中對(duì)CtBP1的點(diǎn)突變，并進(jìn)行了詳細(xì)的下游機(jī)制驗(yàn)證。

研究方法
在此項(xiàng)目中研究人員采用了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，包括en face免疫熒光、主動(dòng)脈油紅O染色、Western blotting及Real-time PCR等。在探究CtBP1與FOXP1的結(jié)合對(duì)NLRP3炎癥小體組分轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用時(shí)，研究人員使用了CHIP及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。此外，研究人員還測(cè)量了胞內(nèi)NADH的水平。

技術(shù)路線
01 AS中NLRP3炎癥小體與PFKFB3的表達(dá)相關(guān)性
02 體內(nèi)外抑制PFKFB3對(duì)NLRP3炎癥小體及AS進(jìn)程的影響
03 PFKFB3調(diào)控NLRP3炎癥小體的分子機(jī)制
04 CtBP1寡聚化對(duì)NLRP3炎癥小體和AS的調(diào)控作用及其機(jī)制

研究結(jié)果
1. AS斑塊中NLRP3及PFKFB3在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)
首先，研究人員發(fā)現(xiàn)在人頸動(dòng)脈AS斑塊中發(fā)現(xiàn)NLRP3和PFKFB3在內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，并且二者存在線性關(guān)系（R²=0.4272，P=0.0212）。en face免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與野生型小鼠相比，Apoe^-/-小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮中的PFKFB3和NLRP3水平明顯升高。提取主動(dòng)脈內(nèi)膜RNA行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Apoe^-/-小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮中的PFKFB3、NLRP3、CASP1以及IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高。以上結(jié)果提示PFKFB3與NLRP3的表達(dá)量與AS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且二者之間存在顯著相關(guān)性。

圖1 NLRP3及PFKFB3在AS病理狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)^[1]

2. 內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)了NLRP3炎癥小體和AS斑塊的形成
隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)使用siRNA敲低PFKFB3或使用PFKFB3的特異性抑制AZ67可以顯著緩解TNFα刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）及人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）所引起的NLRP3炎癥小體的形成和激活。隨后，干預(yù)PFKFB3所介導(dǎo)的糖酵解也可以抑制血流狀態(tài)下內(nèi)皮與白細(xì)胞之間的相互作用。為了在體研究?jī)?nèi)皮PFKFB3對(duì)NLRP3炎癥小體激活和AS進(jìn)程的影響，研究人員構(gòu)建了內(nèi)皮特異性PFKFB3敲除鼠（Pfkfb3^VEC-KO）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照鼠相比，Pfkfb3^VEC-KO小鼠的主動(dòng)脈中NLRP3的表達(dá)明顯下調(diào)。給予小鼠高脂飲食喂養(yǎng)后，Pfkfb3^VEC-KO小鼠顯著緩解了AS斑塊的形成。以上結(jié)果提示，體內(nèi)外干預(yù)內(nèi)皮中的PFKFB3可以緩解NLRP3炎癥小體的形成和激活，并緩解AS斑塊的形成。此外，研究人員使用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)PFKFB3調(diào)控了NLRP3炎癥小體組分基因的轉(zhuǎn)錄活性。
 

圖2 內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)了NLRP3炎癥小體和AS斑塊的形成^[1]

3. 糖酵解依賴性的NADH水平介導(dǎo)了NLRP3炎癥小體形成
先前的研究表明，糖酵解速率升高所產(chǎn)生的NADH可以起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，從而架起代謝與表觀遺傳調(diào)控之間的橋梁。研究人員首先發(fā)現(xiàn)，TNFA刺激顯著上調(diào)內(nèi)皮中的NADH水平和NADH/NAD+的比例。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)使用丙酮酸降低NADH水平可以緩解NLRP3炎癥小體形成；相反，使用乳酸鈉回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)上調(diào)NADH水平則可以逆轉(zhuǎn)敲低PFKFB3所產(chǎn)生的保護(hù)效應(yīng)。以上結(jié)果提示PFKFB3介導(dǎo)糖酵解的對(duì)NLRP3的調(diào)控作用依賴于胞內(nèi)NADH水平的改變。
 

圖3 糖酵解依賴性的NADH水平介導(dǎo)了NLRP3炎癥小體形成^[1]

4. NADH敏感型蛋白CtBP1的寡聚化介導(dǎo)了NLRP3激活和斑塊形成
先前的研究表明，CtBP1是NADH敏感型蛋白之一，通過(guò)響應(yīng)胞內(nèi)不斷變化的NADH水平發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。首先，結(jié)果表明TNFA促進(jìn)了CtBP1的寡聚化。隨后，研究人員使用CtBP1寡聚化抑制劑MTOB及突變CtBP1的寡聚化關(guān)鍵位點(diǎn)（G183A）可以緩解NLRP3炎癥小體的形成和激活。隨后研究人員構(gòu)建了內(nèi)皮細(xì)胞CtBP1(G183A)過(guò)表達(dá)AAV病毒（試驗(yàn)所用AAV病毒由賽業(yè)生物提供）。給予Apoe^-/-小鼠尾靜脈注射CtBP1(G183A)過(guò)表達(dá)AAV病毒可以顯著抑制NLRP3炎癥小體的形成和AS進(jìn)程。
 

圖4 CtBP1的寡聚化介導(dǎo)了NLRP3激活和斑塊形成^[1]

5. 單體形式的CtBP1與FOXP1結(jié)合抑制NLRP3組分基因的轉(zhuǎn)錄
CtBP1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用需要與之協(xié)同的轉(zhuǎn)錄因子，研究人員通過(guò)生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)了CtBP1的結(jié)合蛋白及共同調(diào)節(jié)NLRP3、CASP1及IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄因子。并通過(guò)IP、CHIP及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)單體形式的CtBP1與轉(zhuǎn)錄因子FOXP1結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制了NLRP3炎癥小體組分基因的轉(zhuǎn)錄水平。
 

圖5 單體CtBP1與FOXP1結(jié)合抑制NLRP3組分基因的轉(zhuǎn)錄^[1]

研究結(jié)論
此項(xiàng)研究首次證實(shí)內(nèi)皮PFKFB3介導(dǎo)的糖酵解調(diào)控了NLRP3炎癥小體的形成和激活和AS斑塊形成。機(jī)制探索表明糖酵解依賴性的NADH水平升高介導(dǎo)了CtBP1的寡聚化及其與FOXP1的解離，進(jìn)而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體組分基因的轉(zhuǎn)錄激活。此項(xiàng)研究也首次闡明干預(yù)CtBP1的寡聚化可以緩解AS進(jìn)程，為AS防治提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。
 

圖6 機(jī)制圖^[1]

參考文獻(xiàn)：
[1]Shuai Guo, Litao Wang, Kaixiang Cao, Ziling Li, Mingchuan Song, Shuqi Huang, Zou Li, Cailing Wang, Peiling Chen, Yong Wang, Xiaoyan Dai, Xianglin Chen, Xiaodong Fu, Du Feng, Jun He, Yuqing Huo, Yiming Xu, Endothelial nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome regulation in atherosclerosis, Cardiovascular Research, 2024;, cvae071, https://doi.org/10.1093/cvr/cvae071