熒光超分辨顯微術淺析與活細胞超分辨成像新進展
本文作者：錢佳銘博士
南京理工大學智能計算成像實驗室
光學顯微鏡
光學顯微鏡（optical microscopy），顧名思義，是通過光學手段將人眼所不能分辨的微小物體放大成像，以供人們提取微細結構的光學儀器。如今，光學顯微鏡已發(fā)展成為許多基礎研究和工程應用中的核心技術，廣泛應用于生命科學、生物學、物理學、化學、材料科學、納米技術、工業(yè)檢測、醫(yī)學等領域，為人類的發(fā)展做出了不可磨滅的重大貢獻。早在三百多年前，人類就已經(jīng)使用光學顯微鏡觀察肉眼無法分辨的微觀物體。1662年，英國物理學家羅伯特·胡克（Robert Hooke，1635—1703年）使用自制的顯微鏡觀察軟木切片，發(fā)現(xiàn)其在放大后呈現(xiàn)出類似修道院單人居室的微觀結構，并以拉丁語“Cella”（“細胞”英文單詞“Cell”的由來）命名這些結構，意為“小房間”或“小隔間”。這是人類歷史上第一次觀察到細胞。
圖1 胡克所著關于顯微鏡的首本書籍《顯微圖譜》（Micrographia）。(a) 《顯微圖譜》封面。(b) 胡克觀察到的軟木微觀結構，并將其命名為“Cella”。(c) 胡克改進的復式顯微鏡。(d) 胡克觀察到的跳蚤圖像
3年后，胡克記錄了使用顯微鏡進行的各種觀察并出版了首部關于顯微鏡的著作——《顯微圖譜》（Micrographia）（圖1），書中包含大量繪制精美的動、植物機體微觀結構圖像，開創(chuàng)了科學界利用圖畫方式進行交流的先河�！讹@微圖譜》的出版使人們意識到微觀世界和宏觀世界一樣豐富多彩，其中有許多未知的奧秘等待著被探索。同一時期，荷蘭商人列文虎克（Antoni van Leeuwenhoek，1632—1723年）制造出當時“最強”的光學顯微鏡，可實現(xiàn)300倍放大率，并持續(xù)“稱霸”了一個多世紀。
1676年春天，在用顯微鏡對雨水進行持續(xù)幾天的觀察后，列文虎克發(fā)現(xiàn)水中有很多在活動的小生命，并給英國皇家學會寄去了包含這些發(fā)現(xiàn)的信件，其中有這樣一段話：“我判斷，即使把一百個這些小動物撐開擺在一起，也不會超過一顆粗沙子的長度；如果這是真的，那么一百萬個這些活物也不夠一顆粗沙粒的體積。”這段文字中的“小動物”，就是我們現(xiàn)在熟知的細菌（圖2）。這是人類首次發(fā)現(xiàn)活體細菌，并由此開創(chuàng)了微生物學，為人類對生物學和顯微鏡的研究開啟了一個新時代。
圖2 列文虎克制作的顯微鏡及記錄手稿。(a) 列文虎克制作的顯微鏡，先存于烏得勒支大學博物館。(b) 列文虎克繪制的細菌。(c) 列文虎克寄給英國皇家學會的書信之一
隨后，光學顯微技術經(jīng)歷了不斷的革新，以越來越高的分辨率與成像質量，引導人類向無盡的微觀世界發(fā)起無窮的探索（圖3）。特別是上世紀以來，隨著人類對生命現(xiàn)象本質研究的逐漸深入，生命科學涉及問題的日益深化，檢驗醫(yī)學對快速準確檢測手段需求的不斷提高，光學顯微技術得到了突飛猛進的發(fā)展。
圖3 不同時期的奧林巴斯顯微鏡。依次為1920年“旭號”顯微鏡、1927年“昭和號”顯微鏡、1980年“BH2”系列顯微鏡、1983年“AH2”系列顯微鏡、1993年“BX”系列顯微鏡、1996年“MX50”顯微鏡、“IX3”系列研究型倒置顯微鏡、IXplore spinSR超分辨共聚焦顯微鏡
超分辨熒光顯微成像技術
1873年，德國物理學家恩斯特·阿貝（Ernst Karl Abbe，1840—1905年）提出了光學成像系統(tǒng)的衍射極限理論，指出光學顯微鏡的分辨率極限大約是可見光波長的一半（約200nm），這被稱為“阿貝極限”1,2。該問題困擾著科學家長達一個世紀之久，這一時期光學顯微鏡的應用一直被限制在細胞水平而無法在亞細胞層面進行高分辨成像。
21世紀初，受激發(fā)射損耗顯微術3（stimulated emission depletion，STED）、結構光照明顯微術4（structured illumination microscopy，SIM）、單分子定位顯微術5,6（photoactivated localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy，PALM/STORM）等超分辨成像技術繞開了百余年來似乎一直被認為是無法突破的阿貝衍射極限，在納米尺度至單分子水平可視化生物分子，以前所未有的時空分辨率探究活細胞結構和動態(tài)過程，成為生命科學研究中不可或缺的重要工具。
2014年，諾貝爾化學獎授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner三位科學家，以表彰他們對超分辨熒光顯微成像技術的重大貢獻，再一次展現(xiàn)了該技術在人類發(fā)展歷程中以及未來發(fā)展方向上的重要地位7。
圖4 2014年，諾貝爾化學獎授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner三位科學家，以表彰他們對超分辨率熒光顯微成像技術的重大貢獻
· 單分子定位的顯微術
在基于單分子定位的超分辨顯微成像技術中，PALM由2014年諾貝爾獎得主之一Betzig8提出，該技術基于熒光分子的光轉化能力和單分子定位，通過用光控制每次僅有少量隨機離散的單個熒光分子發(fā)光，并準確定位單個熒光分子點擴散函數(shù)的中心，最終利用多次曝光疊加成一幅超高分辨率圖像（圖5）。
由Hess9提出的熒光活化定位顯微術（fluorescence photoactivation localization microscopy, fPALM）與PLAM原理相似，熒光團經(jīng)探測器成像后，由光強控制熒光分子被可逆地滅活或不可逆地光漂白而從視場中消失。由Zhuang等10提出的STORM技術與PALM技術在原理上類似，其利用化學小分子Cy3和Cy5、Cy7等熒光分子對的光轉換效應同樣可以達到突破光學極限的效果。與PALM區(qū)別在于其所利用的探針是化學小分子而不是生物大分子。因此，STORM需要利用熒光發(fā)色團標記抗體對靶蛋白進行識別，可以檢測到內源性蛋白，避免PALM中由于外源性表達偶聯(lián)熒光蛋白的靶蛋白對其定位產(chǎn)生的可能的影響。2014年，三個小組分別報道了互補式可激活型熒光蛋白系統(tǒng)，在哺乳動物（PAGFP11和PAmCherry12）和大腸桿菌中（mEos3.213）實現(xiàn)了熒光互補和超高分辨率成像，對二聚化或相互作用蛋白的超高分辨率成像具有重要應用價值�；趩畏肿佣ㄎ坏某直骘@微成像技術可實現(xiàn)10~30nm的橫向分辨率，但由于反復激活和淬滅熒光分子，所需時間長，其時間分辨率較低。
圖5 PALM原理示意圖與結果圖。(a)-(c) PALM原理示意圖，其中圖(a)為探測的單個原始光子圖像，圖(b)對對圖(a)的高斯擬合，圖(c)為定位的圖(a)的中心。(d) 聚苯乙烯微球的寬場圖像。(e) 疊加原始PALM堆棧數(shù)據(jù)中單分子圖像所獲取的聚苯乙烯微球圖像。(f) 聚苯乙烯微球的PALM超分辨圖像· 受激發(fā)射損耗顯微術
STED是一種基于點擴散函數(shù)調制的超分辨技術，其最早由2014年諾貝爾獎得主之一Hell14–16提出。STED采用兩束共軸激光，分別為激發(fā)光和損耗光。在激發(fā)光的照射下，基態(tài)的熒光分子吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)并發(fā)射出熒光；再使用環(huán)形損耗光將第1束光斑周圍的熒光物質通過受激損耗過程滅活，只保留位于中間部位的納米尺度區(qū)域以減少熒光光點的衍射面積，通過掃描記錄即可獲取整個樣品的完整圖像17。STED顯微鏡的橫向分辨率可達20~70nm，憑借超高的分辨率，STED很快被應用于生物細胞研究并取得一系列重要的新發(fā)現(xiàn)17。
但是，由于STED本身屬于點掃描成像技術，為了提升成像速度，STED通常需要高的激發(fā)強度（~107W/cm2）來記錄足夠的光子以換取時間分辨率，所導致的光毒性和光漂白限制了STED在活細胞成像中的應用。
圖6 STED的超分辨原理示意圖和結果圖16。(a) STED典型光學系統(tǒng)。(b) STED超分辨原理。(c) 微管寬場圖
像。(d) 微管STED超分辨圖像
· 結構光照明顯微術
另一種典型的基于點擴散函數(shù)調制的超分辨技術是SIM技術。如前所述，成像系統(tǒng)的分辨率受到阿貝衍射極限的限制，存在接近波長一半尺度的衍射極限，物場信息中高于此光學傳遞函數(shù)截止頻率的成分將會被濾除。針對這一問題，Gustafsson18于2000年提出了SIM技術，其基本原理是通過結構化照明在頻域以空間混頻的方式將物體高頻信息載入光學系統(tǒng)的探測通帶內實現(xiàn)突破阿貝衍射極限的超分辨光學顯微成像。當利用周期性結構正弦照明光激發(fā)樣品時，在頻域上由于結構光頻譜與物頻譜的卷積而產(chǎn)生攜帶物體信息的多級頻譜。其中±1級頻譜將攜帶物體細節(jié)信息的高頻部分平移至截止頻率范圍內而被探測，如圖7所示。但這些高頻信息與0級頻譜的低頻信息疊加在一起，需要后期數(shù)據(jù)處理（如相移、反卷積、參數(shù)估計等）將三級頻譜分開才能有效獲得樣品的高頻信息19。由于結構光條紋照射在樣品上也受到系統(tǒng)衍射限制，因此等效截止頻率最多可拓展一倍，即SIM的分辨率最多能在衍射極限基礎上提高一倍，達到非相干衍射極限的2倍，約在100nm20。盡管SIM對橫向分辨率的提升不如PALM、STORM、STED等技術，但其高的光子效率、較快的成像速度和全場成像等優(yōu)點使得其非常適合進行活細胞的超分辨成像。值得注意的是，光柵衍射效應不僅僅限于±1級頻譜，例如矩形光柵的頻譜就要豐富得多，其還包括±2級、±3級等高階頻譜。
因此，假如能采用矩形光柵作為結構光，則可以產(chǎn)生多級頻譜，使等效截止頻率得到多次拓展從而大幅提高分辨率。但由于結構光的產(chǎn)生也受到光學系統(tǒng)有限孔徑的限制，直接在物平面上形成一個周期接近衍射極限分辨率的矩形光柵并不現(xiàn)實。針對此問題，Gustafsson21在傳統(tǒng)SIM的基礎上進一步提出了飽和結構光照明顯微技術（saturated SIM，SSIM），巧妙地利用熒光分子的飽和激發(fā)使樣品在正弦光波激發(fā)下發(fā)出具有高階頻率分量的非正弦結構光，從而實現(xiàn)多級頻譜拓展[如圖7(b)]，將分辨率提高到了約50nm的水平。然而飽和照明所需的高強度激光增加了SSIM的光毒性與光漂白，無法發(fā)揮SIM高光子效率、低光損傷的優(yōu)勢，使其難以運用于活細胞成像，因此并未得到廣泛應用。
圖7 SIM的超分辨原理示意圖及超分辨結果。(a) 線性結構光照明顯微術的光路及頻譜調制過程。(b) 飽和結構光照明顯微技術的頻譜調制過程。(c) COS-7細胞中f-肌動蛋白的飽和SIM超分辨圖像及不同方法的對比結果（左上：寬場，右上：反卷積，左下：SIM，右下：SSIM）。(d) 不同方法下COS-7細胞中質膜微囊的超分辨圖像（左上：寬場，右上：反卷積，左下：SIM，右下：SSIM）。(e) 活體COS-7細胞中質膜微囊的SSIM超分辨結果18,21,22
實時活細胞超分辨顯微成像
實時活細胞超分辨顯微成像
在上述超分辨成像技術中，SIM具有寬視場、快速成像、光漂白和光毒性弱以及對熒光染料的非特異性需求等獨特優(yōu)勢，因此特別適合于活細胞的長時程超分辨成像23–25。盡管有著諸多優(yōu)勢，SIM仍然受到一些技術上的挑戰(zhàn)，其高質量超分辨圖像的數(shù)值重建很大程度上依賴于對照明參數(shù)的精確估計，這些參數(shù)的微小誤差會對重建結果產(chǎn)生重大影響，導致干擾定量的重建偽影26,27。此外，“變化多端”的照明參數(shù)對實驗環(huán)境極為敏感，除非嚴格保持成像條件穩(wěn)定，否則需要在每幀超分辨圖像重建前從獲取的原始觀測數(shù)據(jù)中進行逐幀的照明參數(shù)提取28,29。目前最廣泛使用的基于迭代互相關（iterative cross-correlation method, COR）的參數(shù)估計法通過實空間相位梯度形式的亞像素優(yōu)化提取高精度的照明參數(shù)（波矢、初相位、調制度）30。然而，COR的性能受到維持活細胞長期成像所需的低光漂白和光毒性的嚴苛成像條件所導致的低信噪比的影響，且復雜耗時的迭代優(yōu)化過程大大降低了SIM的圖像重建效率，對快速、實時、長時程、無偽影的活細胞動態(tài)超分辨成像構成了嚴峻挑戰(zhàn)。
近日，來自南京理工大學的陳錢、左超教授課題組提出一種高效、魯棒的基于主成分分析的結構光照明顯微技術（PCA-SIM），首次實現(xiàn)了在有外界干擾的復雜、低信噪比實驗環(huán)境下對照明參數(shù)的快速自適應精準補償和對活細胞精細結構的實時、高質量動態(tài)超分辨成像31。他們發(fā)現(xiàn)，理想無干擾條件下的結構光照明相量矩陣應是一個秩-1矩陣，其僅包括一個“主成分”，在最小二乘意義上描述了相量矩陣處于一個單一維度的“特征子空間”。然而，由于噪聲、光學像差、樣品非均勻調制度等干擾因素，通常情況下實驗上所獲得的相量矩陣會存在不規(guī)則的高維分量。如何消除這些高維干擾分量以獲得對應理想照明相量矩陣中單一“主成分”，將是低信噪比條件下進行SIM準確參數(shù)估計的關鍵。
圖8 基于主成分分析的結構光照明顯微技術流程圖。(a) 原始SIM圖像及分離的三個頻譜成分。(b) 被整像素頻移的1級頻譜。(c1) 對圖b逆傅里葉變換所得頻譜的相位圖。(c2) 圖c1中藍色方框區(qū)域的相位圖。(c3) 圖c2的理想形式。(c4) 圖c3的絕對相位（歸一化為-π到π）。亞像素波矢表現(xiàn)為理想相位的斜率，但其湮沒于各種干擾導致的嚴重噪聲中。(d) 從頂部至底部依次為：原始相位，使用掩蔽算子后的相位，使用PCA后的相位，最小二乘法擬合后的相位。使用掩膜算子和PCA后，原始相位中的不相關成分被有效地去除，“凈化”后的相位分布接近于理想形式。(e) 從底部至頂部依次為：獲取的亞像素精度的波矢及合成的超分辨頻譜
主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是最重要的數(shù)據(jù)降維方法之一，其利用正交變換把由線性相關變量表示的原始數(shù)據(jù)轉換到少數(shù)幾個由線性無關變量表示的低維度子空間上，稱為主成分。這恰恰與前面所述的從相量矩陣中準確估計照明參數(shù)所要完成的任務不謀而合。因此，研究人員利用PCA的“降維”特性，將實驗采集到的照明相量矩陣中的干擾成分剔除，以提取由照明參數(shù)主導的“第一主成分”，從根本上消除了影響照明參數(shù)精確估計的干擾項，從而以簡單高效的方式精準識別亞像素精度的波矢量與初相位（圖8）。研究人員進一步發(fā)現(xiàn)，理想照明相量矩陣的離散傅里葉逆變換本質上是一個中心能量集中的狄利克雷（Dirichlet）函數(shù)。這種信號的高度局域化啟發(fā)研究人員在頻譜域中引入一種雙窗掩膜算子，在進一步抑制噪聲干擾的同時，將PCA的運算量減少約兩到三個量級，極大改善了照明參數(shù)估計的計算效率、準確性和穩(wěn)定性。高精度、非迭代重建、魯棒的抗噪性和較低的運算量使PCA-SIM為快速、長時程、無偽影的活細胞超分辨成像開辟了一條新途徑。
圖9 研究人員基于奧林巴斯IX73倒置熒光顯微鏡自主搭建的三色干涉式SIM超分辨儀器示意圖。激發(fā)光通過一系列二向色鏡與反射鏡由空間濾波器擴束準直，照射在顯示高頻光柵圖像的空間光調制器上并發(fā)生衍射，±1級衍射光通過顯微物鏡在樣品表面發(fā)生干涉，激發(fā)出的熒光通過物鏡與二向色鏡被相機接收
研究者基于PCA-SIM實現(xiàn)了對活體COS-7細胞線粒體的實時超分辨成像，依靠的平臺是基于奧林巴斯IX73倒置熒光顯微鏡自主搭建的三色干涉式SIM超分辨儀器（圖9）。圖10給出了部分實時觀測的活體COS-7細胞的線粒體動態(tài)小管事件（mitochondrial dynamic tubulation，MDT）。如圖10(a)-10(b)，細長且高度動態(tài)的MDT小管從線粒體中不斷延伸，并與其他線粒體發(fā)生融合，形成了兩個線粒體之前的膜橋。隨后MDT小管逐漸增厚并趨于穩(wěn)定，最終構成線粒體網(wǎng)絡。這些實驗現(xiàn)象對研究線粒體網(wǎng)絡的形成以及線粒體功能（如線粒體DNA完整性、細胞凋亡等）的維持具有重要意義。PCA-SIM為研究活細胞中納米尺度結構演化、細胞器互作和生物分子動力學信息提供了一種快速實時、靈活便捷、低光損傷的成像新手段，在生命科學、基礎醫(yī)學等領域具有廣闊的應用前景。
圖10 在不同時間點對COS-7細胞線粒體的實時超分辨重建結果。其中線粒體通過MitoTrackerTMGreen FM標記。(a), (d) 寬場圖像和PCA-SIM獲得的超分辨圖像。原始圖像通過原始圖像通過60X 1.42NA物鏡（UPlanXApo 60X 1.42 Oil）獲取。(b), (c) 圖a中藍色方框內區(qū)域在不同時間點的超分辨圖像。(e), (f)圖d中藍色和白色方框內區(qū)域在不同時間點的超分辨圖像
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品介紹
最后，我們介紹上述工作中所使用到的關鍵設備：
【IX3系列研究級倒置顯微鏡】
IX3系列(IX53/73/83)作為能提供活細胞成像的高度可擴展的光學平臺，其建立在雄厚的技術基礎之上，擁有靈活的結構，容易利用的光路，提供高分辨，高反差的寬場圖像。一切設計基于用戶的心聲，科學家的工作流程需要，廣泛應用在細胞生物學，神經(jīng)生物學，發(fā)育生物學，分子生物學，光生物學等領域，將成為科研工作者進行更高水平的活細胞研究的有力武器。
【X Line（翼系列）平場超復消色差物鏡】
X Line（翼系列）平場二代超復消色差物鏡(PlanXApo)，在平場超復消色差（PlanSApo）物鏡的技術基礎上突破創(chuàng)新，在平場性、色差矯正和分辨率三項技術的層面兼收并舉，同時囊括三項技術的尖端參數(shù)要求，滿足高質量、大視場、高分辨率精確成像的要求，可以說，一枚物鏡就可以讓我們看得更多、更細、更美，也更自由。
Reference
1. 左超 & 陳錢. 分辨率, 超分辨率與空間帶寬積拓展—從計算光學成像角度的一些思考. 中國光學 中英文 15, 1105–1166 (2022).
2. 左超, 陳錢, & others. 計算光學成像: 何來, 何處, 何去, 何從? 紅外與激光工程 51, 20220110 (2022).
3. Westphal, V. et al. Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement. Science 320, 246–249 (2008).
4. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82–87 (2000).
5. Betzig, E. et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 313, 1642–1645 (2006).
6. Rust, M. J., Bates, M. & Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods 3, 793–796 (2006).
7. Weiss, P. S. Nobel prizes for super-resolution imaging. (2014).
8. Betzig, E. et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science 313, 1642–1645 (2006).
9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. & Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258–4272 (2006).
10. Rust, M. J., Bates, M. & Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods 3, 793 (2006).
11. Xia, P. et al. Superresolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell 25, 4166–4173 (2014).
12. Nickerson, A., Huang, T., Lin, L.-J. & Nan, X. Photoactivated localization microscopy with bimolecular fluorescence complementation (BiFC-PALM) for nanoscale imaging of protein-protein interactions in cells. PloS One 9, e100589 (2014).
13. Liu, Z. et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 4443 (2014).
14. Hell, S. W. & Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett.19, 780–782 (1994).
15. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A. & Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 8206–8210 (2000).
16. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. science 316, 1153–1158 (2007).
17. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R. & Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.Nature 440, 935 (2006).
18. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82–87 (2000).
19. Eggeling, C., Willig, K. I., Sahl, S. J. & Hell, S. W. Lens-based fluorescence nanoscopy.Q. Rev. Biophys. 48, 178–243 (2015).
20. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L. & Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods 6, 339 (2009).
21. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 102, 13081–13086 (2005).
22. Li, D. et al.Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science 349, aab3500–aab3500 (2015).
23. Li, D. et al.Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science 349, (2015).
24. Markwirth, A. et al. Video-rate multi-color structured illumination microscopy with simultaneous real-time reconstruction. Nat. Commun. 10, 1–11 (2019).
25. Wang, Z. et al. High-speed image reconstruction for optically sectioned, super-resolution structured illumination microscopy. Adv. Photonics 4, 026003 (2022).
26. Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W. & Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nat. Commun. 7, 1–6 (2016).
27. Huang, X. et al. Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat. Biotechnol. 36, 451–459 (2018).
28. Shroff, S. A., Fienup, J. R. & Williams, D. R. Phase-shift estimation in sinusoidally illuminated images for lateral superresolution. J. Opt. Soc. Am. A 26, 413 (2009).
29. Wicker, K. Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space. Opt. Express 21, 24692 (2013).
30. Gustafsson, M. G. L. et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophys. J. 94, 4957–4970 (2008).
31. Qian, J. et al. Structured illumination microscopy based on principal component analysis. eLight 3, 4 (2023).
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