食品微生物快速檢測技術(shù)研究動(dòng)態(tài)-中國微生物菌種查詢網(wǎng)
       食物病原微生物是食品安全的重要內(nèi)容，而對其的快速檢測（驗(yàn)）一直是相關(guān)研究的熱點(diǎn)。近年來，微生物的快速檢測和自動(dòng)化研究進(jìn)展迅速。依靠培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、分離及生化鑒定的傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。快速檢測及其自動(dòng)化則綜合引用微生物學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)、生物物理學(xué)、免疫學(xué)以及血清學(xué)試驗(yàn)技術(shù)對微生物進(jìn)行分離、檢測、鑒定和計(jì)數(shù)。和傳統(tǒng)方法比較，更快、更方便、更靈敏。因此，在醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)境等方面得到了廣泛了應(yīng)用下面介紹幾種食品微生物快速檢測技術(shù)。

1. 氣相色譜法
其原理是將微生物細(xì)胞經(jīng)過水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后，使之分離盡可能多的化學(xué)組分供氣相色譜儀進(jìn)行分析。不同的微生物所得到的色譜圖中，通常大多數(shù)的峰是共性的，只有少數(shù)的峰具有特征性，可被用來進(jìn)行微生物鑒定。分析檢測各種常見細(xì)菌、酵母菌、霉菌等。

2.“既用膠”測定法
把1ml食物樣品傾入一盛有無菌液體培養(yǎng)基的試管中，混勻后再將混合物倒入一個(gè)裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中。混合物與膠質(zhì)接觸后便形成瓊脂相似的復(fù)合物。經(jīng)培養(yǎng)后便可計(jì)數(shù)菌種及數(shù)量。
該系統(tǒng)是包裝好的產(chǎn)品，用時(shí)不需滅菌，極適合野外測定。目前，這種系統(tǒng)正在受到美國AOAC的鑒定。

3. 以生物化學(xué)手段建立的快速檢測技術(shù)
3.1微生物專有酶快速反應(yīng)系統(tǒng)的檢測技術(shù)
微生物專有酶快速反應(yīng)是根據(jù)細(xì)菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應(yīng)的底物和指示劑，將他們配制在相關(guān)的培養(yǎng)基中。根據(jù)細(xì)菌反應(yīng)后出現(xiàn)的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應(yīng)的測定結(jié)果有助于細(xì)菌的快速診斷。這種技術(shù)將傳統(tǒng)的細(xì)菌分離與生化反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來，并使得檢測結(jié)果直觀，正成為今后微生物檢測發(fā)展的一個(gè)主要發(fā)展方向。
3.2常規(guī)的致病微生物檢測技術(shù)
不同病原體的化學(xué)組成或所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各異，利用微生物（主要是細(xì)菌）的不同生化和生理特性，可以對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。生化鑒定是檢測細(xì)菌最常用的方法。細(xì)菌檢驗(yàn)中的微量化和自動(dòng)化，是微生物學(xué)診斷中的發(fā)展方向，經(jīng)過多年的研究和不斷改進(jìn)，常規(guī)的臨床細(xì)菌學(xué)診斷己由系列的試劑盒商品成套供應(yīng)，來替代各檢驗(yàn)部門自行配制試劑、手工操作的緩慢和繁瑣工作。
另外，氣相色譜和高效液相色譜的分析也應(yīng)用到致病微生物的檢測中，主要是依據(jù)不同病原體的化學(xué)組成或所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各異，利用上述色譜檢查可直接分析各種體液中的細(xì)菌代謝產(chǎn)物、細(xì)胞中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學(xué)標(biāo)志成分，協(xié)助病原診斷和檢測，其中以氣相色譜應(yīng)用較多，該法簡單、快速。

4. 以免疫學(xué)方法建立的快速檢測技術(shù)
免疫檢測的基本原理是抗原抗體反應(yīng)�？乖�抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。不同的微生物有其特異的抗原，并能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體。在免疫檢測中，可利用單克隆抗體檢測微生物的特異抗原，也可利用微生物抗原檢測體內(nèi)產(chǎn)生的特異抗體，兩種方法均能判斷機(jī)體的感染狀況。
4.1免疫熒光技術(shù)
免疫熒光技術(shù)（immunofluorescenceTechnique）是用熒光素標(biāo)記的抗體檢測抗原或抗體的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)，又稱熒光抗體技術(shù)。所用的熒光素標(biāo)記抗體通稱為熒光抗體，免疫熒光技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加己知特異性熒光標(biāo)記的抗血清，經(jīng)洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法是在檢樣上滴加己知的細(xì)菌特異性抗體，待作用后經(jīng)洗滌，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于 750 例食品樣品的檢測，結(jié)果表明與常規(guī)培養(yǎng)法符合率基本一致。免疫熒光直接法可清楚地觀察抗原并用于定位標(biāo)記觀察。
4.2酶免疫測定技術(shù)
酶免疫測定（enzymeimmunoassay, EIA）根據(jù)抗原抗體反應(yīng)是否需要分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物而分為均相和非均相兩種類型。非均相法較常用，包括液相免疫測定法與固相免疫測定法。固相免疫測定法的代表技術(shù)是ELISA。ELISA技術(shù)是抗原或抗體吸附到固相載體上作為一種試劑來檢測標(biāo)本中抗體或抗原的一種方法。根據(jù)反應(yīng)原理，加入某種酶標(biāo)記的抗體或抗原，洗滌除去未結(jié)合物，加入該酶的底物，酶催化底物生成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物的量有關(guān)，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺可定量測定。
EIA 在微生物學(xué)領(lǐng)域中可用于病原的檢測、抗體檢測和細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測。EIA具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有可溶性的抗體抗原反應(yīng)系統(tǒng)均可檢測。與放射免疫方法相比較，EIA的標(biāo)記試劑較穩(wěn)定，且無放射性危害；與免疫熒光技術(shù)相比，EIA敏感性高，不需特殊設(shè)備，結(jié)果觀察簡便。
 4.3免疫印跡技術(shù)
免疫印跡（immunoblot）法分三個(gè)步驟：第一，SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。將蛋白質(zhì)抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶。第二，電轉(zhuǎn)移。目的是將凝膠中己分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第三，酶免疫定位，該步的意義是將前兩步中己分離，但肉眼不能見到的抗原帶顯示出來。將印有蛋白抗原條帶的硝酸纖維素膜依次與特異性抗體和酶標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)后，再與能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物作用，最終使區(qū)帶染色。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特異性，是一種有效的分析手段。
4.4免疫組織化學(xué)方法
是應(yīng)用免疫學(xué)中的抗原抗體反應(yīng)，借助可見的標(biāo)記物，在組織原位顯示抗原或抗體的方法。常用的免疫組織化學(xué)方法有熒光免疫和酶免疫組化技術(shù)、金標(biāo)免疫組織化學(xué)技術(shù)和免疫電鏡，該技術(shù)特點(diǎn)是對細(xì)胞涂片、印片、組織切片進(jìn)行處理和染色鏡檢。免疫組化技術(shù)彌補(bǔ)了上述血清學(xué)診斷方法的不足，使得在細(xì)胞或組織內(nèi)檢測病原微生物成分成為可能。對于在宿主組織液中微量表達(dá)或不表達(dá)抗原、抗體的微生物，免疫組化具有較好的輔助診斷價(jià)值。利用免疫組化技術(shù)，還能觀察被侵犯組織致病微生物繁殖和對組織破壞情況。
 
5. 估計(jì)微生物數(shù)量和菌量的新方法
通過微生物生長所引起的物理、生物化學(xué)、生物物理指標(biāo)的變化來對樣品中的微生物量進(jìn)行估計(jì)，其中有ATP水平、阻抗和導(dǎo)電、接觸酶的測定等。
化學(xué)發(fā)光的原理：利用可發(fā)光化學(xué)物質(zhì)測定被分析物質(zhì)的濃度。所有生物體的磷酸核苷酸（ATP）含量是相對固定的，當(dāng)螢火蟲酶系統(tǒng)和ATP接觸時(shí)，發(fā)生光生物學(xué)反應(yīng)，就會(huì)發(fā)光。在熒光素和熒光酶過量時(shí)，熒光強(qiáng)度與ATP(含量成正比關(guān)系。用ATP生物發(fā)光確定細(xì)菌總數(shù)的準(zhǔn)確程度依賴于從食品樣品中細(xì)菌分離的效果和實(shí)驗(yàn)前將樣品本身的ATP消除的程度。
阻抗測定的原理：當(dāng)細(xì)菌生長時(shí)，將大分子物質(zhì)降解成小的帶高電荷的粒子，從而改變周圍培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能。通過測定阻抗或電導(dǎo)變化，可以了解生物活動(dòng)情況。當(dāng)微生物含量達(dá)到某一值時(shí)，阻抗的變化與微生物含量呈相關(guān)性，即與污染程度呈相關(guān)性。
微熱量計(jì)法（Microcalorimetry）：利用細(xì)菌生長而產(chǎn)生熱量的原理設(shè)計(jì)而成。微生物在生長過程中產(chǎn)生熱量，雖然產(chǎn)生的量很小，但仍能通過敏感的微熱量計(jì)進(jìn)行測量。用微熱量計(jì)對微生物計(jì)數(shù)時(shí)，溫譜圖必須與絕對微生物細(xì)胞數(shù)呈相關(guān)性，一旦建立了參考溫譜圖，食品樣品溫譜圖便可與之相比較而得到微生物的絕對數(shù)量。
放射測量法（Radiometric）：利用細(xì)菌代謝碳水化合物而產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性標(biāo)記引入葡萄糖或其他糖類分子中，細(xì)菌生長時(shí)，糖被利用并放出含放射標(biāo)記的CO2。有一種儀器（Bactec）可用來測定放射性CO2，放射量與菌數(shù)成正比。這一方法適用于測定食品中的細(xì)菌.
接觸酶實(shí)驗(yàn)：利用接觸酶反應(yīng)來估計(jì)食品中微生物含量。由這一原理設(shè)計(jì)出的儀器稱為接觸酶測定儀（Catakasneter）。其原理是通過計(jì)算一個(gè)含有接觸酶的紙盤，在盛有H2O2的試管中的漂浮時(shí)間來估計(jì)菌數(shù)。當(dāng)樣品中接觸酶含量高時(shí)（表明接觸酶陽性細(xì)菌含量高），紙盤上浮的時(shí)間短（以 s計(jì)）；反之，接觸酶的濃度低，紙盤上浮的時(shí)間長（以100s~1000s計(jì)）。

6. 分子生物學(xué)方法
DNA探針（Gene-Trak）。DNA探針共有兩種類型：一種是含有放射性標(biāo)記的探針；另一種是無放射性標(biāo)記的探針。放射性標(biāo)記的核酸探針的特異性非常強(qiáng)，檢測病原微生物速度比常規(guī)法快得多。非放射性標(biāo)記的核酸探針類型很多，應(yīng)用較廣泛的有用生物素 - 抗生物素蛋白系統(tǒng)標(biāo)記的非放射性核酸探針。生物素 - 抗生物素蛋白系統(tǒng)標(biāo)記的探針已在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒檢測中得到了應(yīng)用。
PCR(PolymeraseChaninReaction)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱。利用PCR檢測食品中的致病菌，可以對那些人工難以培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測。由于在所有細(xì)菌中編碼,rRNA的一些基因保守性很強(qiáng)，因此可用 (PCR擴(kuò)增其相應(yīng)的DNA片斷，來快速、靈敏地檢測樣品中是否存在某些細(xì)菌或致病菌，尤其是那些人工無法培養(yǎng)的微生物。最近又設(shè)計(jì)了一種DNA指紋圖譜自動(dòng)分析系統(tǒng)——Ribo Printer (Dupont de Nemours公司產(chǎn)品）。具體操作是從細(xì)菌細(xì)胞中提取DNA，接著用限制性酶將DNA降解成片段，DNA片段通過電泳得到分開，再轉(zhuǎn)移至雜交膜上與 DNA探針雜交。由于引入了化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，雜交片段發(fā)出的光線被相機(jī)捕獲，得到的核酸圖譜與其他貯存的DNA核酸堿基序列進(jìn)行比較，通過核酸匹配分析可以對微生物進(jìn)行鑒定。

7. 活細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測
自動(dòng)旋轉(zhuǎn)平板和激光菌落掃描計(jì)數(shù)法，在均勻薄層瓊脂營養(yǎng)基表面，以阿基米德螺旋線方式將液體樣品從中心到邊緣均勻涂在平板上。經(jīng)過培養(yǎng)在計(jì)數(shù)格區(qū)間內(nèi)計(jì)數(shù)，或用激光計(jì)數(shù)器來掃描平板，以透過光的強(qiáng)度來檢測菌落的存在。Petrifium系統(tǒng)(3MCoSt.Paul, Minn)用可重新水化的營養(yǎng)成分取代瓊脂傾注平板。把這種營養(yǎng)成分和一種膠態(tài)試劑一起嵌入在一系列薄膜上。取1mL液體樣品滴于膜系統(tǒng)中央，重新水化的培養(yǎng)基便可作為微生物生長的支持物，經(jīng)過培養(yǎng)后，便可像常規(guī)平皿計(jì)數(shù)一樣直接在膜系統(tǒng)上對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。Petrifilm2000系列從菌群鑒定到結(jié)束只需培養(yǎng)8h。
Redigel系統(tǒng)（RCR Scientific）由多種營養(yǎng)成分與果膠混合并裝入試管，混勻后無需溶解凝膠。試樣直接加入試管后倒入覆蓋有一層鈣質(zhì)的培養(yǎng)皿中，倒入液體與鈣質(zhì)形成果膠鈣。培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
疏水網(wǎng)膜（HGMF）技術(shù)是常規(guī)平皿劃線方法的改進(jìn)。樣品用疏水網(wǎng)膜過濾，要檢測的微生物被捕獲在疏水網(wǎng)膜的小格中。在接種后的疏水網(wǎng)膜上傾入適當(dāng)?shù)沫傊�，在適當(dāng)時(shí)間培養(yǎng)后即可計(jì)數(shù)。由于菌落都是正方形，人工或機(jī)械計(jì)數(shù)都很方便�？捎糜诮湍负兔咕�計(jì)數(shù)、沙門氏菌檢測、大腸桿菌/大腸菌群檢測。