氣相色譜- 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定農(nóng)藥殘留的方法驗證
Laszlo Hollosi, Katerina Bousova, Michal Godula
賽默飛世爾科技, 食品安全應(yīng)用中心，德國Dreieich
關(guān)鍵詞
TraceFinder，TSQ8000，氣相色譜，GC，GC-MS/MS，農(nóng)藥殘留，QuEChERS，三重四極桿
1.方法示意圖
2. 前言
食品中農(nóng)藥殘留的分析是實驗室日常工作中最重要和最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。歐洲法規(guī)規(guī)定了植物和動物來源的各種產(chǎn)品中農(nóng)藥的最大殘留限量（MRL），是目前世界上最嚴格的法規(guī)（歐洲法規(guī)396/2005 和指令2006/125/EC）。這些法規(guī)要求一些特定的食品基質(zhì)有很低的定量檢出限（LOQ），針對這些基質(zhì)的分析是一個很大的挑戰(zhàn)。目前已經(jīng)有各種各樣的GC 和HPLC 方法結(jié)合各種樣品前處理和凈化技術(shù)用于多種農(nóng)藥殘留的測定。近年來，QuEChERS方法被廣泛的應(yīng)用在水果和蔬菜的樣品前處理，但是隨著對測定方法的靈敏度和準確度的要求越來越高，同樣需要儀器生產(chǎn)廠商不斷進步。
本文方法中樣品前處理采用QuEChERS 試劑盒，樣品測定采用最新開發(fā)的Thermo ScientificTM TSQTM 8000 PesticideAnalyzer 系統(tǒng)，并采用Thermo ScientificTM TraceFinderTM 軟件進行快速的數(shù)據(jù)分析。本文介紹了完整的多農(nóng)藥殘留的測定方法的內(nèi)部方法驗證結(jié)果，以及對方法性能參數(shù)的評估。
3. 范圍
本方法驗證研究的目的是證明一種能應(yīng)用在一些有代表性的基質(zhì)（草莓、小麥粉和韭菜）中的多農(nóng)藥殘留（大約140 種優(yōu)先的農(nóng)藥）的日常分析的完整工作流程及解決方案（由Thermo Scientific 化學品、消耗品和儀器提供）。此方法符合現(xiàn)行法規(guī)的要求，方法的檢出限（LOQ）與MRL 值一致，具有良好的靈敏度1-4。
4. 原理
取出部分事先均質(zhì)好的樣品（對一些不穩(wěn)定的化合物，建議在低溫下研磨），采用標準的QuEChERS 方法（萃取和凈化）進行樣品前處理，然后進樣到TSQ 8000 Triple-Stage Quadrupole GC-MS/MS 系統(tǒng)5,6。
現(xiàn)成的QuEChERS 試劑盒包括萃取管和凈化管， 以及相關(guān)的樣品前處理操作方法（賽默飛世爾科技，英國Runcorn）。農(nóng)藥殘留的鑒定是基于保留時間，并用特征離子對在選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式下的離子比進行驗證，而定量采用的是基質(zhì)匹配校準曲線和內(nèi)標法。所有的方法性能標準是根據(jù)相關(guān)的指導方針而設(shè)定的1-4,7。
5. 試劑列表
6. 標準樣品單
6.1 農(nóng)藥
所有單個的農(nóng)藥化合物均購自Sigma-Aldrich® ( 德國) 和Laboratory Instruments Srl ( 意大利CASTELLANA GROTTE)，包括乙酰甲胺磷、氟丙菊酯、雙甲脒、保棉磷、嘧菌酯、聯(lián)苯菊酯、聯(lián)苯三唑醇、啶酰菌胺、溴螨酯、溴菌唑、乙嘧酚磺酸酯、噻嗪酮、硫線磷、克菌丹、西維因、克百威、萎銹靈、蟲螨腈、毒蟲畏、乙酯殺螨醇、百菌清、氯苯胺靈、乙基毒死蜱、甲基毒死蜱、氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、環(huán)丙唑醇、嘧菌環(huán)胺、滴滴滴、滴滴伊、滴滴涕、溴氰菊酯、甲基內(nèi)吸磷、二嗪磷、苯氟磺胺、氯硝胺、二氯二苯甲酮、敵敵畏、開樂散、苯醚甲環(huán)唑、樂果、烯酰嗎啉、二苯胺、硫丹、硫丹硫酸鹽、苯硫磷、氟環(huán)唑、乙硫磷、滅線磷、醚菊酯、苯線磷、苯線磷砜、苯線磷亞砜、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、殺螟硫磷、苯氧威、甲氰菊酯、苯銹啶、丁苯嗎啡、倍硫磷、氰戊菊酯、氟蟲腈、咯菌腈、氟喹唑、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、氟胺氰菊酯、滅菌丹、α- 六六六，β- 六六六，γ- 六六六（林丹）、己唑醇、抑霉唑、異菌脲、甲基異柳磷、醚菌酯、利谷隆、馬拉硫磷、嘧菌胺、甲霜靈、蟲螨畏、甲胺磷、殺撲磷、滅蟲威、嗪草酮、久效磷、腈菌唑、鄰苯基苯酚、噁草酮、噁霜靈、多效唑、甲基對氧磷、對硫磷（乙基）、甲基對硫磷、二甲戊靈、氯菊酯、稻豐散、伏殺硫磷、亞胺硫磷、磷胺、抗蚜威、對脫甲基抗蚜威、甲基嘧啶磷、咪酰胺、腐霉利、丙溴磷、炔螨特、丙環(huán)唑、炔苯酰草胺、丙硫磷、唑菌胺酯、噠螨靈、嘧霉胺、吡丙醚、喹氧靈、螺螨酯、戊唑醇、蟲酰肼、吡螨胺、七氟菊酯、四氟醚唑、三氯殺螨砜、四氫酞酰亞胺、噻苯咪唑、甲基立枯磷、甲苯氟磺胺、三唑酮、三唑醇、肟菌酯、氟樂靈、滅菌唑、乙烯菌核利。
6.2 內(nèi)標物
1- 溴-4- 氟苯（BFB）和磷酸三苯酯（TPP）（購自Sigma-Aldrich，德國）。
6.3 質(zhì)量控制材料
FAPAS #19140QC ( 生菜), FAPAS #19141QC ( 青刀豆) 和FAPAS#19142QC ( 瓜泥)。
注意：FAPAS 樣品的選擇主要是基于目標農(nóng)藥成分的含量。但是由于樣品有限，選擇的基質(zhì)與驗證的基質(zhì)稍有不同。
7. 標準樣品和試劑配制
7.1 單個農(nóng)藥標準儲備液
在十萬分之一分析天平上稱取每種農(nóng)藥單標化合物10 mg，分別倒入到20 mL 棕色螺口帶蓋樣品瓶中，加入10 mL 相應(yīng)的溶劑（根據(jù)不同的化合物加入丙酮、甲苯或者乙腈）溶解，配制成濃度為~ 約1000 mg/L 的溶液。每種單個標準儲備液的濃度根據(jù)稱樣量和加入溶劑的體積計算得到。所有單標儲備液在-20℃冰箱中冷凍保存。單標儲備液的有效期為6 個月。
7.2 中間標準儲備液和工作標準溶液
移取適量的單標儲備液，用乙腈稀釋。中間標準儲備液的濃度為5000 ng/mL。進一步稀釋配制得到工作標準溶液。中間標準儲備液在-20℃冰箱中冷凍保存，工作溶液保存在4℃冰箱中。中間儲備液的有效期為3 個月。
7.3 單個內(nèi)標物儲備液
在十萬分之一分析天平上稱取每種農(nóng)藥單標化合物10mg，分別倒入到20 mL 棕色螺口帶蓋樣品瓶中，加入10mL 丙酮到TPP 中，加入10 mL 甲苯到BFB 中，配制成濃度為~1000 mg/L 的溶液。溶液的準確濃度根據(jù)稱樣量和加入溶劑的體積計算得到。所有單個內(nèi)標物儲備液在-20℃冰箱中冷凍保存。單個內(nèi)標物儲備液的有效期為6 個月。
7.4 內(nèi)標物工作標準儲備液
分別移取適量的單個標準儲備液，用乙腈稀釋。內(nèi)標物工作標準儲備液的濃度為5000 ng/mL，可直接用于樣品的加標。工作儲備液的有效期為3 個月。
7.5 1% 山梨醇溶液（分析物保護劑）
在體積比為70/30% 的乙腈/ 水溶液中配制，進樣前加入樣品中。進樣前加入保護劑溶液的目的是防止分析物的交互反應(yīng)和進樣過程中的損失8。
8. 儀器
9. 耗材
10. 玻璃器皿
11. 實驗步驟
11.1 樣品前處理
用于方法驗證實驗的空白基質(zhì)樣品 （草莓（SB），小麥粉（WF）和韭菜（LK））購自當?shù)亓闶凵痰�。在樣品前處理前，將空白基質(zhì)樣品在Ultra-Turrax 均質(zhì)器上均質(zhì)處理、提取和凈化�；|(zhì)提取物用于基質(zhì)空白樣品，稀釋溶劑用于基質(zhì)匹配校準。樣品前處理采用現(xiàn)成的Thermo Scientific QuEChERS萃取試劑盒，包括4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g 無水檸檬酸三鈉和0.5 g 檸檬酸二鈉組成的緩沖劑，用于目標化合物的萃取。預(yù)先準備好的凈化管含有1200 mg MgSO4，400 mg PSA 和400mg C18，用于提高更復(fù)雜的樣品基質(zhì)的凈化效率，如韭菜。所有的樣品基質(zhì)采用同樣的QuEChERS 方法。
11.1.1 樣品基質(zhì)的均質(zhì)
11.1.1.1 選取較大量的草莓（約500 g）和一把韭菜基質(zhì)，加入到適當大小的燒杯中，貼上標簽。
11.1.1.2 在Ultra-Turrax 均質(zhì)器上裝上G25 解膠工具。（建議一些不穩(wěn)定的化合物采用冷凍均質(zhì)以提高回收率。）
11.1.1.3 中等速度（速度水平2-3）下開始均質(zhì)，直到形成光滑的勻漿。
11.1.2 樣品萃取和凈化
11.1.2.1 稱取10 g 樣品到50 mL QuEChERS 萃取管中。萃取管中含有4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g 無水檸檬酸三鈉和0.5 g 檸檬酸二鈉。
11.1.2.2 在樣品中加入200 μL 5000 ng/mL 的內(nèi)標物#141。
11.1.2.3 在SB 和LK 樣品中加入10 mL ACN。對于WF 樣品，先加20 mL 水使樣品完全濕潤，然后加入10 mL ACN。
11.1.2.4 樣品在水平震蕩儀上震蕩10 min，然后在5000rpm 轉(zhuǎn)速下離心5 min。將上清液（約8 mL）轉(zhuǎn)移到15 mL QuEChERS 凈化管，凈化管中包括1200 mg MgSO4，400 mg PSA 和400 mg C18。
11.1.2.5 旋渦震蕩樣品1 min，然后在5000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心5 min。
11.1.2.6 收集上清液，取1 mL 加入到GC 進樣瓶中，用于儀器分析。
11.1.2.7 進樣前在樣品瓶中加入50μL 山梨醇溶液（保護劑）和20 μL 5000 ng/mL 進樣標準溶液（BFB）。
11.2 GC-MS/MS 分析
樣品測定采用TRACE 1310 氣相色譜與TSQ 8000 三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)（農(nóng)藥殘留分析手冊）。儀器控制、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理和報告采用TraceFinder 3.1 軟件。
11.2.1 GC 方法設(shè)置
進樣器參數(shù)設(shè)置如下：
表1. GC 程序升溫設(shè)置
11.2.2 三重四極桿MS 設(shè)置
質(zhì)譜檢測使用TSQ 8000 三重四極桿質(zhì)譜儀的Timed-SRM 模式完成。所有的方法和SRM 設(shè)置來自Thermo Scientific TSQ8000 Pesticide Analyzer 系統(tǒng)6。離子比值根據(jù)每種待測基質(zhì)進行修改和設(shè)置。
參數(shù)設(shè)置如下：
11.3 結(jié)果計算
目標農(nóng)藥的定量采用內(nèi)標法。相對響應(yīng)因子（Rf）的定義見如下列方程。按照如下方程計算最終結(jié)果。
11.3.1 方程
響應(yīng)因子的計算：
Rf – 相對響應(yīng)因子
Ast – 校準標樣中農(nóng)藥的峰面積
A[IS] – 校準標樣中內(nèi)標物的峰面積
Cst – 校準標樣溶液中農(nóng)藥的濃度
C[IS] – 校準標樣溶液中內(nèi)標物的濃度
樣品含量的計算（樣品中農(nóng)藥的絕對量）：
樣品含量的計算（樣品中農(nóng)藥的絕對量）：
12.2 線性，響應(yīng)因子，基質(zhì)效應(yīng)
校準曲線建立在六個濃度水平上（基質(zhì)匹配），每個濃度平行進樣兩次。根據(jù)所有基質(zhì)和內(nèi)標物的校準曲線，在整個校準范圍內(nèi)計算了累加平均響應(yīng)因子做為內(nèi)標的Rf 值。校準濃度范圍分別為0-200，0-1000 和0-2000 ng/g 的三組化合物（取決于相關(guān)MRL 值）分別制備了校準曲線（具體結(jié)果見表3）。校準標樣濃度水平的選取為校準曲線范圍內(nèi)等距離分布。線性函數(shù)采用曼德爾擬合方法，曲線殘差應(yīng)小于可接受限的20%3。此外，由于沒有相關(guān)法規(guī)的規(guī)定，將相關(guān)系數(shù)值的最低限設(shè)定為0.985。由于與校準標樣濃度水平相關(guān)的LOQ 值太高，設(shè)定標準不適合甲氰菊酯和苯氟磺胺（LK），以及炔螨特（WF）。沒有采用加權(quán)函數(shù)。
基質(zhì)效應(yīng)采用尤登圖進行評估，以配制在溶劑中和相關(guān)基質(zhì)中的校準標樣的相對峰面積測定值作圖。如果擬合線性與理想曲線（y=x）斜率的差別（dif%）小于20%，則認為沒有基質(zhì)效應(yīng)；當差別在20-50% 之間時，有較小基質(zhì)效應(yīng)；當差別超過50%，有較大基質(zhì)效應(yīng)�；|(zhì)效應(yīng)的結(jié)果如表3 所示。對于已證明有基質(zhì)效應(yīng)的化合物，要求采用基質(zhì)匹配校準曲線。
12.3 準確度
方法的準確度用回收率實驗進行評估，在空白基質(zhì)中加入三個濃度水平的標樣（L1，L2 和L3），每個濃度平行配制并進樣六次（表4）。在樣品前處理之前加入標樣。計算得到測定濃度、回收率和相對標準偏差（%RSD）如表5 所示。根據(jù)SANCO 的要求，回收率在70-120% 之間被認為是可以接受的3。只有加標的濃度水平高于基質(zhì)中化合物的LOQ 時才計算回收率。由于加標濃度水平比LOQ值更低，沒有得到WF 中的雙甲脒和LK 基質(zhì)中的克菌丹、百菌清和甲苯氟磺胺的回收率值。一些情況下，基質(zhì)對結(jié)果有很大影響，由于不同基質(zhì)測定的LOD/LOQ 值有所差別，有一到兩個加標濃度下沒有得到回收率值（詳見表4）。對于日常測定這些基質(zhì)中的這幾個化合物，則需要采用其余的方法，特別是優(yōu)化的分析方法。采用從FAPAS（英國約克郡）獲得的外部質(zhì)量控制材料確定方法偏差。這些FAPAS 材料包括#19140QC（生菜泥），#19141QC（青刀豆泥）和#19142QC（瓜泥）。這些材料只代表一定數(shù)量的目標化合物和含有這些化合物的不同基質(zhì)。但是，除了克百威的測定值稍低于標準范圍，其余所有情況下的測定都很好的符合規(guī)定值。這可能是由于兩種不同基質(zhì)特性的差異引起的。FAPAS 測定值詳見表7。
12.4 精密度
將低濃度的標樣溶液（L1）連續(xù)進樣（n=6）測定所有目標化合物的保留時間和峰面積，計算得到儀器的進樣精密度。在沒有內(nèi)標補償?shù)那闆r下，所有化合物的儀器進樣精密度測定中，保留時間低于0.5%，峰面積在1.2-18.04%之間（氟蟲腈和苯線磷亞砜），顯示了可靠的儀器性能。連續(xù)三天測定分別配制的中等加標濃度（L2）的各個基質(zhì)樣品（n=6），得到方法的日內(nèi)和日間精密度值，用%RSD表示。取三天內(nèi)每天測定結(jié)果的平均精密度的平均值做為平均日內(nèi)精密度，而日間精密度則為所有精密度數(shù)據(jù)的平均值。按照SANCO 的要求，所有的目標化合物和基質(zhì)的精密度的可接受標準為<20%3。精密度測定值見表5。
12.5 檢出限，定量檢出限
按照IUPAC 方法測定檢出限和定量檢出限。方法LOD 和LOQ 的測定值，以及相關(guān)法規(guī)限值（MRLs）如表6 所列7。對于沒有法規(guī)規(guī)定MRL 值的化合物，將MRL 目標值設(shè)定為10 ng/g。絕大多數(shù)目標化合物都符合MRL 值，至少與LOQ 值一樣的要求。滅蟲威（WF，LK）、克百威（SW）、噁霜靈（WF）和炔螨特（WF，LK）的LOQ 值超出MRL 值要求。但是，交換定量和定性離子也能達到目標值。甲氰菊酯（WF，LK），雙甲脒（WF）和蟲酰肼（所有基質(zhì)）即使交換了定量和定性離子仍然達不到目標值。
12.6 耐用性
耐用性實驗通過改變一些參數(shù)來測定，如實驗人員、提取和凈化批次。結(jié)果與原方法進行對比，采用ANOVA 分析是否存在顯著性差異。這些參數(shù)的變化不會導致測量值的顯著性差異，顯示了良好的方法耐用性。
13. 結(jié)論
本文完成了用于日常農(nóng)藥殘留測定的方法的完整內(nèi)部驗證。研究的目的是客觀可靠地評價一種廣泛使用和接受的樣品前處理方法配合先進的分析儀器的方法分析性能。方法性能參數(shù)顯示大多數(shù)目標化合物的性能符合現(xiàn)行法規(guī)的要求。采用獨立的外部質(zhì)量控制材料提高了測定結(jié)果的可信賴程度。在一些情況下，由于化合物的特性和基質(zhì)對分析結(jié)果的較大影響，無法確定方法性能參數(shù)或者測定值落到目標范圍以外。對這些化合物（在相關(guān)基質(zhì)中），必須單獨優(yōu)化前處理方法（額外或特殊的凈化）和儀器分析方法。從實際操作上來說（特別是針對不穩(wěn)定或活性化合物），可以在每40-50 次進樣后更換襯管（和隔墊）以獲得最佳的性能�？偠灾�，由賽默飛世爾科技提供的完整工作流程解決方案連同最新開發(fā)的TSQ 8000GC-MS/MS 系統(tǒng)為目標化合物的分析和準確定量帶來了良好的系統(tǒng)性能，特別是在靈敏度、選擇性和回收率方面。
14. 參考文獻
1. European Commission 2002/657/EC
2. European Commission 2006/125/EC
3. European Commission SANCO/12495/2011
4. European Commission 788/2012/EC
5. Fussell et al. (2007) Food Additives & Contam, 24:1247-1256
6. Thermo Scientific TSQ 8000 Pesticide Analyzer Brochure, https://static.thermoscientific.com/images/D22018~.pdf
7. EU Pesticides Database, http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm
8. Anastassiades et al. (2003) J. Chromatogr A, 1015:163-184
15. 附錄
圖表
表2. 目標化合物的選擇性參數(shù)
* 所有異構(gòu)體的保留時間 ** 內(nèi)標化合物
表3. 線性和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（尤登圖斜率結(jié)果詳見正文12.2）
表4. 10 ng/g（水平1），20 ng/g（水平2）和100 ng/g（水平3）加標濃度下的回收率值[%]
* 加標濃度為50,100 & 500 ng/g ** 加標濃度為100,200 & 1000 ng/g <LOD/LOQ – 加標量低于LOD/LOQ 值
表5. 10 ng/g（水平1），20 ng/g（水平2）和100 ng/g（水平3）濃度下的方法精密度和中間精密度值[RSD%]
*加標濃度為50,100 & 500 ng/g ** 加標濃度為100,200 & 1000 ng/g <LOD/LOQ – 加標量低于LOD/LOQ 值
表6. 方法LOD，LOQ 和現(xiàn)行法規(guī)規(guī)定殘留限量（單位ng/g）
* 由于沒有MRL 規(guī)定值，默認設(shè)置為10 ng/g
表7. 相關(guān)化合物的外部質(zhì)量控制樣品（FAPAS）結(jié)果
圖1. 韭菜中校準濃度水平2[5 ng/g] 的甲基異柳磷的色譜圖
圖2. 韭菜中校準水平2[5 ng/g] 的滅線磷的色譜圖
圖3. 韭菜中校準水平3[10 ng/g] 的氯菊酯的兩個色譜峰
圖4. 小麥粉中校準水平6[100 ng/g] 的克菌丹的色譜圖
圖5. 小麥粉中校準水平4[25 ng/g] 的鄰苯基苯酚的色譜圖
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