RNAi實(shí)驗(yàn)原理與方法選擇
一、RNAi的分子機(jī)制
通過(guò)生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3’端都有2個(gè)堿基突出。
在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過(guò)程。激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。
另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默.
二、如何進(jìn)行RNAi試驗(yàn)
(一)siRNA的設(shè)計(jì)
1. 在設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：
http://www./business/products/order2.htm
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.RNAi目標(biāo)序列的選取原則：
(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%―55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。
Tuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。
(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。
例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3.陰性對(duì)照
一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性。
4.目前已證實(shí)的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到：
http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html
http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html
http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published
二)siRNA的制備
目前為止較為常用的方法有通過(guò)化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過(guò)siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。
1． 化學(xué)合成生產(chǎn)siRNA
優(yōu)點(diǎn)：方便，研究人員幾乎不需要做什么工作。
缺點(diǎn)：價(jià)格較貴，效率只有轉(zhuǎn)錄合成的shRNA的1/10-1/40，基因抑制持續(xù)時(shí)間短，對(duì)細(xì)胞毒性大，轉(zhuǎn)染效率低，此外由于合成工藝上存在不可彌補(bǔ)的缺陷，此方法不能合成shRNA，不能糾正合成中產(chǎn)生的20%左右的堿基錯(cuò)誤。
適用于：建議不再采用此種合成方法。
不適用于：基本上對(duì)目前所有的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)均不適用。
評(píng)價(jià)：☆☆☆☆☆
2． 生物合成轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)編碼siRNA
優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格較低，抑制效率高，低濃度的siRNA即可達(dá)到抑制效果。體外轉(zhuǎn)錄合成，比較接近生理狀態(tài)。
缺點(diǎn)：無(wú)法保證有效性，實(shí)驗(yàn)規(guī)模受到限制，不能進(jìn)行大量的生產(chǎn)，不能維持長(zhǎng)時(shí)間抑制效應(yīng)，而且需要用戶參與操作，難以保證實(shí)驗(yàn)的一次成功性。
適用于：篩選siRNAs特別是需要制備多種siRNAs，考慮合成價(jià)格時(shí)。
不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。
評(píng)價(jià)：★★★☆☆
盡管有些公司推出了shRNA和siRNA試劑盒，但這些試劑盒大都突出操作簡(jiǎn)單，畢竟涉及RNA操作，用戶自己難免會(huì)產(chǎn)生很多預(yù)料不到的困難，晶賽公司可以完全為您解決后顧之憂，您可以直接拿到有效的siRNA或shRNA序列。
3． Dicer酶法生產(chǎn)siRNA
優(yōu)點(diǎn)：可以跳過(guò)篩選與檢測(cè)有效siRNA序列的步驟，節(jié)省時(shí)間和開(kāi)支。
缺點(diǎn)：有可能引發(fā)非特異性的基因沉默，尤其是同源或者密切相關(guān)的基因。
適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型
不適用于：長(zhǎng)期研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究
評(píng)價(jià)：★★★☆☆
4．編碼shRNA的載體生產(chǎn)siRNA
優(yōu)點(diǎn)：制備質(zhì)量可控性好，帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久，可以大量擴(kuò)增。
缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄后的shRNA的正確折疊率不能保證，有可能因此造成非特異性抑制，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定，與細(xì)胞類型有關(guān)。
適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。長(zhǎng)期研究。
不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作
評(píng)價(jià)：★★★★☆
晶賽公司擁有一項(xiàng)編碼shRNA的載體生產(chǎn)siRNA的專利技術(shù)，最多可以一次編碼6個(gè)目標(biāo)基因的siRNA序列，為您節(jié)省了篩選時(shí)間，保證了siRNA的有效性。具體詳情：http://www./html/products.htm#6
5．病毒粒子生產(chǎn)shRNA
優(yōu)點(diǎn)：易于制備、純化、濃縮,宿主范圍廣,感染率高,理化性質(zhì)穩(wěn)定,不整合宿主基因組,遺傳毒性和免疫毒性低，是目前最好的RNA干擾技術(shù)之一。
缺點(diǎn)：耗費(fèi)時(shí)間比較長(zhǎng)，即使是用最快的也得60天左右，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，容量偏小，有可能伴隨部分炎癥反應(yīng)。
適用于：轉(zhuǎn)染效率低無(wú)法解決，需要維持較短時(shí)間的基因沉默的siRNA
不適用于：大量篩選siRNA或長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素
評(píng)價(jià)：★★★★★
晶賽公司擁有一項(xiàng)未公布的病毒制備技術(shù)，可以在15天內(nèi)完成shRNA病毒制備，價(jià)格接近shRNA制備的其他方法，將極有可能取代常規(guī)病毒表達(dá)shRNA的方法成為最佳的RNA干擾技術(shù)。
6．PCR制備shRNA表達(dá)框生產(chǎn)siRNA
優(yōu)點(diǎn)：成本較低，方便快捷，可以用于有效序列的篩選，可以用于質(zhì)粒載體構(gòu)建。
缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率低，不適合大規(guī)模制備。
適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子
不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）
評(píng)價(jià)：★★★☆☆
晶賽公司推薦給您的RNAi實(shí)驗(yàn)方法的參考模式：
1． 確立需要干擾的目標(biāo)基因
2． 檢查使用細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況
可以選擇一個(gè)4kb左右大小的質(zhì)粒和可實(shí)施的轉(zhuǎn)染方法，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率
轉(zhuǎn)染效率超過(guò)40%：可以選擇任何一種RNA干擾方法。
轉(zhuǎn)染效率介于10%-40%：可以選用體外合成的si RNA或者帶有篩選標(biāo)記的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體。
轉(zhuǎn)染效率低于10%：帶有篩選標(biāo)記的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體或病毒載體。
3． si RNA序列選擇設(shè)計(jì)
制備20-30個(gè)si RNA序列，選擇有效序列或委托專業(yè)化公司（如：晶賽生物）設(shè)計(jì)（3個(gè)序列保證1個(gè)有效）
4． 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)
三、RNAi的應(yīng)用前景
1. 研究基因功能的新工具
已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲(chóng)和果蠅的全部基因組序列已測(cè)試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進(jìn)對(duì)這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來(lái)RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。
2. 研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑
聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemensy等應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑,取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系, 證實(shí)了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)
染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)， 因此認(rèn)為RNAi技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑。
3.開(kāi)展基因治療的新策略
RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)，防止自私基因序列過(guò)量增殖等作用，因此可以利用RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒。
腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng), 而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性, 設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。
盡管目前RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用還處于探索階段，但它在斑馬魚(yú)和老鼠等脊椎動(dòng)物中的成功應(yīng)用預(yù)示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分，人工合成的dsRNA寡聚藥物的開(kāi)發(fā)將可能成為極具發(fā)展前途的新興產(chǎn)業(yè)。
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