編者按

VIB單細胞中心實驗室的負責人Niels Vandamme博士分享了Flex基因表達分析如何以合理的成本提供操作上的靈活性和可擴展性，實現(xiàn)從脆弱樣本中獲得高質量數(shù)據(jù)。此外，他們的“獨門秘籍”可進一步降低實驗成本。

——根特大學VIB單細胞中心實驗室負責人Niels Vandamme博士

為科學家掃清研究障礙，充分利用其樣本和預算，是VIB單細胞中心實驗室的成員們感到興奮和獲得成就感的源泉。強大的單細胞技術（包括Flex基因表達分析）及多年的實踐經(jīng)驗是這項能力的核心。

近期我們采訪了VIB單細胞中心實驗室的負責人Niels Vandamme博士，請他談談中心實驗室如何支持研究人員，以及他們使用Flex分析時體驗到的一些優(yōu)勢。繼續(xù)閱讀本文，了解Flex帶來的靈活性，以及Flex如何憑借穩(wěn)健的數(shù)據(jù)質量贏得了他們的持續(xù)青睞。同時，您還將看到他們如何通過靈活搭配試劑盒這一獨特方式，為客戶有效降低成本。

作為VIB單細胞核心實驗室的負責人，您在引進新技術時會考慮哪些因素？

作為一個團隊，我們始終響應用戶需求，同時也會預判用戶的需求。因此，我認為制定一份完整的未來路線圖至關重要，可確定哪些需求將得到充分滿足。我們試圖確定哪些有望成為長期的技術和技術平臺，以解決當前的瓶頸。

在發(fā)現(xiàn)具有顛覆性潛力的技術時，我們會迅速行動并嘗試整合。一旦開始，我們要驗證該技術是否切實可行。

Niels Vandamme博士與VIB單細胞核心實驗室的項目經(jīng)理Ria Roelandt正在使用Hamilton Vantage平臺。實驗室已在該平臺上實現(xiàn)10x Genomics工作流程的全自動化，確保單細胞處理的一致性和可擴展性。
 

Niels Vandamme博士與VIB Spatial Catalyst項目的科學家Elina Kuznecova正在使用Visium CytAssist平臺，該平臺支持空間轉錄組學項目，這些項目由單細胞核心實驗室和Spatial Catalyst團隊共同維護和優(yōu)化。

在采用單細胞測序開展項目時，與您合作的研究人員最常擔心或考慮哪些因素？

他們通常擔心這套工作流程過于復雜。我們能輕松調整和適應，并打消他們的顧慮，因為單細胞核心實驗室作為某種一站式平臺，可提供從始至終的服務。我們提供清晰的預算概覽，以及全套服務的考慮因素，包括單細胞分選、測序和數(shù)據(jù)處理等。

在新項目啟動時，研究人員會考慮起始量要求和樣本完整性。他們往往擔心是否能收集足夠的細胞，或是否有足夠的材料或細胞核用在項目中。

第二個考慮因素通常是預算。是否能在特定的預算范圍內完成實驗？這涉及到研究目標與實驗資金之間的權衡取舍。

近年來我注意到，另一個新興關注點是備受重視的重復性問題。人們不僅要求實驗結果具有生物學意義，還要求多次實驗之間具有可重復性。

關于可重復性，用戶關心的其他問題包括：避免批次效應，確保實驗設計正確，杜絕實驗混雜因素。若他們使用新的分析或化學試劑，作為核心實驗室，我們有責任確保重大項目全程使用相同的化學試劑。

許多用戶低估了數(shù)據(jù)分析與解讀的難度。我們通常將其視為潛在問題：分析的復雜性可能令人望而卻步。為此，我們在數(shù)據(jù)生成前就早早做好準備，向用戶解釋實際上可回答哪些生物學問題，以及需要哪些實驗設計、深度和重復次數(shù)來支持這些問題。

為了降低分析門檻，我們提供結構化的質量控制報告和標準化數(shù)據(jù)包，用戶可在我們的在線可視化瀏覽器中直接查看，這種瀏覽器與Loupe Browser互為補充。我們還提供Seurat培訓課程，幫助用戶解讀結果并微調分析。同時我們與內部的生物信息學家緊密合作，讓研究人員從原始數(shù)據(jù)順利過渡到生物學見解，避免因技術復雜性而迷失方向。

您如何幫助研究人員確定單細胞測序項目的合適方案？

我們總是從共同討論開始，明確他們的生物學問題以及期望的分辨率。他們想研究哪些物種、組織、細胞類型和細胞數(shù)量？他們僅僅需要轉錄本還是需要不同方式（CITE-seq、ATAC、多組學等）？

我們首先要弄清他們的需求，再評估具體的限制因素。例如，細胞數(shù)量，特定組織解離的考慮因素，是否涉及到特別難處理的細胞類型？是否有樣本固定方案可以推遲多個生物安全級別的考慮因素？最后，討論往往會停留在我們能為此項目撥出多少預算。

隨后我們會匹配最合適的平臺：采用液滴技術？還是采用微孔、平板技術？此外，是采用靶向方法還是研究整個轉錄組？

咨詢階段可能會花些時間。我們試圖做好充分準備，因為我們在細胞分選、分離、特定組織消化方面擁有豐富的實踐經(jīng)驗，而且在近8年的項目中通過核心實驗室和VIB積累了龐大的內部數(shù)據(jù)庫。當用戶通過電子郵件咨詢特定組織時，我們能準確預判可能出現(xiàn)的情況。在咨詢會議前，我們會回顧過往項目，以便充分準備。同時我們也希望用戶了解到：我們關注其細胞類型的預期結果，以及可能出現(xiàn)的陷阱和問題。

如果存在重大的限制或顧慮，我們會建議進行試點實驗。例如對一或兩個樣本進行技術試點，以便進行質量控制。

您認為Flex基因表達分析的哪些特點對核心實驗室常規(guī)開展的項目最有價值？

我認為三大特點最為重要。首先是固定和存儲樣本的能力，這為時間安排提供了靈活性。對于多中心研究或多地點操作而言，這具有革命性意義，我們核心實驗室本身也是多地點運行。這種化學方法耐受冷凍保存。對我們來說，確保樣本采集與文庫制備的環(huán)節(jié)順利脫鉤至關重要。此外，Flex還展現(xiàn)出卓越的數(shù)據(jù)質量。我認為其表現(xiàn)超出人們預期，堪稱頂級水準。第三個促使人們選擇Flex的優(yōu)勢在于多重分析策略導致成本降低。

我們最先發(fā)現(xiàn)的是固定優(yōu)勢，之后逐步意識到它具有極其出色的質量和穩(wěn)定性。

我們使用Flex分析已有兩三年了，但從未遇到過與分析相關的失敗案例。數(shù)百個項目中僅有兩次失敗，而且均與樣本相關。

您認為將樣本采集與文庫制備分開能為用戶帶來哪些好處？Flex分析如何支持這一過程？

Flex不僅僅是一種化學方法，它已成為一種賦能的工作流程，將單細胞分析能力延伸至我們實驗室之外。我們宣傳Flex不僅能測序樣本，更是存儲樣本的新方式。在我們的研究所和相關生態(tài)系統(tǒng)中，這自然改變了生物學家對樣本保存的看法以及對未來分析的意愿。想想人們通常是如何保存生物材料的：快速冷凍組織，使用RNAlater（一種儲存試劑）或固定樣本用于組織學分析。Flex完全融入了這種思維模式，不過是針對單細胞懸液。

在我們周圍，許多實驗室已常規(guī)生成單細胞懸液用于流式細胞術或分選。因此我們不斷追問研究人員：為什么不采用這種后續(xù)可以隨時測序的方式來保存這些懸液？我們向他們分發(fā)小規(guī)格固定試劑盒和單頁操作方案(1)。

這些是自制的試劑盒，讓每個樣本獨立開展反應。我們提供單獨的“小盒子”，其中含有10支管。10x Genomics的每種緩沖液均按照單樣本用量分裝。每支管上均標明操作步驟（如加入xx µl H2O和xx µl 37% PFA等）。我們還為研究人員提供分裝好的50%甘油溶液，并附帶銷售小規(guī)格的37% PFA試劑管。實際上，我們?yōu)樗麄兲峁┝怂�有必需品！對于某些實驗室，我們會提供一個大規(guī)格的48反應試劑盒，但這種情況很少見。

Vandamme博士慷慨提供了核心實驗室的樣本固定方案(1)。

核心實驗室是否參與了某個令人興奮的項目或研究成果，其中使用了Flex？

作為核心實驗室，我們并非專注于單個項目或某一特性的生物學問題。我們參與了數(shù)百個使用Flex的項目，覆蓋多種組織、樣本類型、細胞類型等。每個項目都對我們具有獨特意義。所得數(shù)據(jù)和生物學解讀也不會局限于我們的平臺，因此很難輕易斷言我們正專注于某一”突破性“成果。

對我們而言，技術突破才是至關重要的——我們優(yōu)化了工作流程，讓分析變得切實可行，從而為客戶解鎖新的研究可能——這一刻對我們至關重要。一旦瓶頸得以消除，便是我們倍感自豪、也是最具成就感的時刻。

讓我們感到興奮的成果之一是snPATHO-seq(2)方法。我們將FFPE組織作為Flex分析的起始材料，因此我們確實能使用生物存檔的材料。這些樣本并非為單細胞測序而準備，在采集和固定這些組織時，研究人員并未考慮過開展單細胞測序。這開啟了大量此前無法使用的新隊列。

以FFPE作為起始材料，我們正推出人類和小鼠樣本的大量操作方案。胰腺樣本曾讓我們大費周折，但如今我們發(fā)現(xiàn)胰腺樣本在Flex分析中的表現(xiàn)優(yōu)于逆轉錄分析或單細胞核。我們還發(fā)現(xiàn)富含中性粒細胞和粒細胞等脆弱細胞類型的樣本也能很好地保存。因此我們對Flex分析、固定過程以及單細胞封裝所用的GEM-X流程充滿信心。我們在Flex分析中使用定制探針，如今也使用CRISPR技術。

此時此刻，這些進展令人興奮，而且技術還在不斷發(fā)展。這不僅僅是固定樣本并開展傳統(tǒng)測序。我們還在探索Flex分析是否能完成新任務，而我們總是設法助其成功。

在使用FFPE材料進行Flex分析時，您是否有其他的質量控制建議？您如何確保最高質量的結果？

FFPE材料在Flex分析中效果不錯，這出乎我們的意料。首先我們會檢查樣本年限及原始制備方式。保持固定和包埋程序的一致性往往比任何下游優(yōu)化都更重要。我們還利用DV200評分來評估RNA質量。

對于一些新收到的樣本，我們會同時進行Flex和Visium HD分析的QC檢查。如果我方或研究人員存在疑慮，我們會建議先進行小規(guī)模試點檢測。如果試點結果良好且后續(xù)項目擴大規(guī)模，我們會登記或抵消試點成本。這是我們維護科學誠信并保護雙方聲譽的方式，畢竟以高成本處理大批低質量的樣本對任何人都無益。

您在核心實驗室開展的一些工作進一步降低了Flex的單樣本成本，請您給我們介紹一下。

我們將低通量試劑盒與高通量試劑盒混搭。這種混搭策略讓條形碼可與GEM-X試劑分開管理。因此我們擁有完整的條形碼和GEM-X庫存。我知道能開展多少個反應以及能分析多少個樣本。我們采用統(tǒng)一的線性定價模式，這樣用戶可選擇1、2、3、4、5、6等任意數(shù)量的樣本。我們不再局限于4或16個。這是一種統(tǒng)一的定價模式，隨著樣本數(shù)量遞增而單價遞減。

Vandamme博士提供的增量式統(tǒng)一定價模式的示意圖（1-16個樣本）�？偝杀倦S樣本數(shù)量成比例增加，而單個樣本的成本則相應減少。這種連續(xù)定價結構取代了固定套餐規(guī)格（如1、4或16個樣本），采用靈活透明的模式，能夠自然適應實驗設計的變化。

對研究人員來說，這種全包式定價模式極具吸引力。他們只需要根據(jù)實際提供的樣本數(shù)量付費，在1到16個樣本范圍內享有可預測的遞增成本（包括基礎測序費用），而不用受限于1、4或16個樣本的固定套餐規(guī)格。這種模式為整個工作流程帶來了靈活性以及透明的成本預期。

您認為單細胞測序或Flex分析最具潛力的增長點在哪里？是否有您特別期待的新功能？

關于Flex分析，我認為自動化的無人值守樣本制備或樣本處理工作站或解決方案將助力核心實驗室的擴展。目前在固定樣本后仍需大量手動操作，因此我們正在積極探索：在進行雜交和混樣之前，如何利用各種類型的上游定量方法和質控流程繞過去。

我認為Flex的多重分析功能最終將通過96個條形碼或384個條形碼的試劑盒實現(xiàn)，從而推動更大規(guī)模的分析。

單細胞測序的增長潛力如何？五年前，每個人都在討論空間和多組學，比如RNA、ATAC、蛋白質和甲基化等。我認為這些方向仍然有效，但增長點不再來源于單一突破，而是通過整合現(xiàn)有的技術實現(xiàn)更深度的分析。

關鍵在于融合，利用更加整合的多組學分析。目前整合各個生物層面的項目仍極為有限。我認為應當更多地整合多個層面，并在數(shù)據(jù)分析層面使用AI工具，為現(xiàn)有的圖譜或數(shù)據(jù)注入新內容。

我認為Flex分析將在其中發(fā)揮核心作用，讓未來的研究實現(xiàn)標準化的樣本庫存儲和固定。我期待看到更多基于固定技術的可靠分析，不僅限于基因表達和蛋白質分析。

通過參考資源的鏈接繼續(xù)探索VIB單細胞核心實驗室的服務(3)，或了解Flex基因表達分析(4)。10x Genomics最近推出了采用板式混樣技術的Flex分析(5)，提供模塊化的試劑盒選項，支持靈活的批量處理，并獨立銷售核心試劑以滿足您特定的實驗設計，這將讓眾多研究人員和核心實驗室受益。

為了清晰起見，并考慮到篇幅限制，訪談內容有所刪減。感謝Vandamme博士對本文的貢獻！

參考資源：

1. https://www.single-cell.be/flex
2. https://www.nature.com/articles/s42003-024-07043-2
3. https://singlecellcore.sites.vib.be/en/services
4. https://www.10xgenomics.com/cn/products/flex-gene-expression
5. https://www.10xgenomics.com/cn/products/flex
 

北京怡美通德科技發(fā)展有限公司是10x Genomics的官方授權代理商，代理美國10x Genomics公司生產(chǎn)的Chromium單細胞測序建庫系列產(chǎn)品、Visium空間轉錄組系列產(chǎn)品以及Xenium組織空間原位分析系統(tǒng)，提供儀器配套的試劑耗材供貨、產(chǎn)品演示實驗、產(chǎn)品安裝、使用培訓以及售前售后技術咨詢、生物信息學分析等相關技術服務。