一 研究目的
associative reward learning（聯(lián)想獎勵學(xué)習(xí)）對生物體生存和適應(yīng)至關(guān)重要，其紊亂與抑郁癥、成癮等神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)�，F(xiàn)有研究多聚焦于中腦多巴胺（DA）神經(jīng)元在該過程中的作用，但對塑造 DA 神經(jīng)元反應(yīng)的傳入通路（如 γ- 氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元）的學(xué)習(xí)介導(dǎo)性變化知之甚少。

已知腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）GABA 神經(jīng)元是 DA 神經(jīng)元的關(guān)鍵調(diào)控者，且應(yīng)激、藥物濫用等會通過下調(diào)鉀氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體 KCC2，改變 VTA GABA 神經(jīng)元的氯離子穩(wěn)態(tài)和 GABA 信號性質(zhì)。但在自然獎勵學(xué)習(xí)過程中，VTA GABA 神經(jīng)元的氯離子穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制尚未明確。

因此，本文的核心研究目的包括：一是明確獎勵學(xué)習(xí)過程中 VTA GABA 神經(jīng)元的氯離子穩(wěn)態(tài)是否發(fā)生動態(tài)變化；二是闡明 KCC2 在該過程中的作用及調(diào)控機(jī)制；三是揭示 VTA GABA 神經(jīng)元功能重塑對 DA 能環(huán)路及線索 - 獎勵關(guān)聯(lián)形成的影響；四是驗(yàn)證該調(diào)控機(jī)制的環(huán)路特異性和時間特異性。

二 研究方法
2.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組
選用 2 月齡、體重 200-500g 的 GAD-Cre、TH-Cre 及野生型 Long-Evans 大鼠，雌雄均有，同窩同性大鼠隨機(jī)分配至實(shí)驗(yàn)組和對照組。大鼠維持 12 小時光暗周期，行為學(xué)測試前進(jìn)行 5 天適應(yīng)處理，測試期間限制進(jìn)食以維持體重的 90%。

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)
采用巴甫洛夫條件反射范式，分為配對訓(xùn)練組和非配對訓(xùn)練組，其中配對訓(xùn)練組設(shè)置 5 秒 4.5kHz 音調(diào)為條件刺激，糖丸為非條件刺激，二者即時配對，每日開展 50 次實(shí)驗(yàn)；非配對訓(xùn)練組的條件刺激與非條件刺激隨機(jī)呈現(xiàn)，間隔 12-30 秒，兩組訓(xùn)練均持續(xù) 13 天。通過分析條件刺激期間與條件刺激前 5 秒的端口進(jìn)入率差異，將學(xué)習(xí)過程劃分為三個階段，分別是第 1 天的基線期、響應(yīng)速率快速上升的獲取期，以及連續(xù) 3 天性能變異小于 10% 的平臺期。

2.3 分子生物學(xué)技術(shù)
病毒注射：向 GAD-Cre 大鼠腹側(cè)被蓋區(qū)注射 Cre 依賴的腺相關(guān)病毒載體，載體類型包括用于標(biāo)記 γ- 氨基丁酸神經(jīng)元的藍(lán)色熒光蛋白、強(qiáng)光下由綠變紅的鈣傳感器 CaMPARI2、可敲低鉀 - 氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2 的短發(fā)夾 RNA，以及用于激活的視蛋白 ChR2、用于抑制的視蛋白 Arch 這兩種光遺傳工具；向 TH-Cre 大鼠伏隔核的不同亞區(qū)，包括外側(cè)殼、內(nèi)側(cè)殼、核心區(qū)，注射逆行腺相關(guān)病毒增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，標(biāo)記投射特異性多巴胺神經(jīng)元。

蛋白質(zhì)印跡法：提取不同學(xué)習(xí)階段腹側(cè)被蓋區(qū)組織蛋白，檢測鉀 - 氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2 總蛋白、磷酸化 S940 - 鉀 - 氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2 及鈉 - 鉀 - 氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體 1 的表達(dá)水平，以甘油醛 - 3 - 磷酸脫氫酶為內(nèi)參。

免疫熒光成像：通過免疫組化標(biāo)記鈣傳感器 CaMPARI2、鉀 - 氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2、多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志物 TH 等，結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)元特異性表達(dá)及分布，驗(yàn)證病毒靶向性和蛋白表達(dá)變化。

圖 1 | 學(xué)習(xí)依賴的 KCC2 下調(diào)改變腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）γ- 氨基丁酸（GABA）神經(jīng)元的 GABA_A 受體逆轉(zhuǎn)電位（E_GABA）

2.4 電生理技術(shù)
離體膜片鉗：制備腹側(cè)被蓋區(qū)水平腦片，采用穿孔膜片鉗記錄 γ- 氨基丁酸神經(jīng)元的 γ- 氨基丁酸 A 型受體逆轉(zhuǎn)電位；全細(xì)胞膜片鉗記錄多巴胺神經(jīng)元的自發(fā)抑制性突觸后電流，分析事件間隔和頻率。

在體電生理：通過四極管或 128 通道硅探針，結(jié)合視蛋白 ChR2 和視蛋白 Arch 的光遺傳標(biāo)記，記錄清醒大鼠腹側(cè)被蓋區(qū) γ- 氨基丁酸和多巴胺神經(jīng)元的放電活動，分析同步性和爆發(fā)式放電參數(shù)；在麻醉大鼠中通過電刺激腳橋被蓋核，誘發(fā)多巴胺神經(jīng)元爆發(fā)式放電。

圖2：VTA GABA神經(jīng)元在學(xué)習(xí)習(xí)得過程中表現(xiàn)出增強(qiáng)的協(xié)調(diào)活動

2.5 光學(xué)技術(shù)
光遺傳學(xué)調(diào)控：通過植入光纖，在行為學(xué)訓(xùn)練或電生理記錄期間，以 10Hz 頻率光刺激視蛋白 ChR2 標(biāo)記的 γ- 氨基丁酸神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的激活與同步；或用 520nm 光抑制視蛋白 Arch 標(biāo)記的 γ- 氨基丁酸神經(jīng)元。

圖3：VTA GABA神經(jīng)元和KCC2下調(diào)對獎勵學(xué)習(xí)有貢獻(xiàn)

光纖光度法：向伏隔核外側(cè)殼注射多巴胺傳感器 GRAB_DA2m，通過光纖記錄線索和獎勵誘發(fā)的多巴胺釋放變化，量化熒光信號的 Z 分?jǐn)?shù)和曲線下面積。

圖4：KCC2功能的變化增強(qiáng)了NAc和VTA中的DA信號傳導(dǎo)

2.6 藥理學(xué)干預(yù)
向腹側(cè)被蓋區(qū)局部微注射鉀 - 氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體 2 激活劑 CLP290、抑制劑 VU0463271 或苯二氮䓬類藥物地西泮，三種藥物濃度分別為 60μM、100μM、5μM，分別在學(xué)習(xí)不同階段進(jìn)行干預(yù)，觀察行為學(xué)和電生理指標(biāo)變化。

圖5：學(xué)習(xí)介導(dǎo)的KCC2下調(diào)影響NAc側(cè)殼投射DA神經(jīng)元

圖6：VTA GABA神經(jīng)元的光遺傳同步增強(qiáng)了刺激誘導(dǎo)的爆發(fā)放電

四 創(chuàng)新點(diǎn)
4.1 首次揭示自然獎勵學(xué)習(xí)中 VTA GABA 神經(jīng)元的氯離子穩(wěn)態(tài)動態(tài)調(diào)控
突破以往聚焦應(yīng)激、藥物等病理?xiàng)l件的研究局限，首次證實(shí)生理狀態(tài)下的獎勵學(xué)習(xí)可誘導(dǎo) VTA GABA 神經(jīng)元 KCC2 短暫去磷酸化（S940 位點(diǎn)），導(dǎo)致氯離子穩(wěn)態(tài)紊亂和 E_GABA 去極化，且該變化僅發(fā)生在學(xué)習(xí)獲取期的激活型 GABA 神經(jīng)元中，具有嚴(yán)格的時間和細(xì)胞特異性

4.2 闡明 KCC2 介導(dǎo)的環(huán)路特異性調(diào)控機(jī)制
明確 KCC2 下調(diào)僅影響投射至 NAc 外側(cè)殼的 DA 能通路，而對 NAc 內(nèi)側(cè)殼和核心區(qū)投射通路無作用，解釋了獎勵學(xué)習(xí)中 DA 信號的環(huán)路特異性編碼機(jī)制，為理解不同 mesoaccumbal 通路的功能分化提供了新視角。

五 啟發(fā)
環(huán)路特異性是神經(jīng)調(diào)控的關(guān)鍵特征：該研究揭示的 KCC2 下調(diào)僅作用于 NAc 外側(cè)殼投射通路，提示未來研究需關(guān)注神經(jīng)機(jī)制的環(huán)路特異性，避免籠統(tǒng)分析中腦 - 伏隔核通路，可通過逆行標(biāo)記等技術(shù)精準(zhǔn)靶向特定投射環(huán)路。

神經(jīng)精神疾病的共同病理基礎(chǔ)：KCC2 功能紊亂在自然獎勵學(xué)習(xí)和藥物濫用、應(yīng)激等病理狀態(tài)中均發(fā)揮作用，提示 KCC2 可能是成癮、抑郁癥等疾病的共同分子靶點(diǎn)，可通過調(diào)控 KCC2 功能干預(yù)異常獎勵學(xué)習(xí)過程。

多技術(shù)整合的優(yōu)勢：該研究通過 “行為學(xué)篩選 + 病毒標(biāo)記 + 電生理記錄 + 光學(xué)調(diào)控” 的整合策略，實(shí)現(xiàn)了從分子到行為的全鏈條驗(yàn)證，為復(fù)雜神經(jīng)機(jī)制研究提供了可借鑒的技術(shù)范式。

鈣傳感器與光遺傳的聯(lián)合應(yīng)用：利用 CaMPARI2 標(biāo)記激活神經(jīng)元、ChR2 同步調(diào)控神經(jīng)元活動，為解析特定功能神經(jīng)元集群的作用提供了高效工具，可廣泛應(yīng)用于各類學(xué)習(xí)記憶和疾病相關(guān)研究。

解鎖神經(jīng)環(huán)路奧秘！我們公司融合在體電生理、光遺傳等精準(zhǔn)監(jiān)測離子穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元放電與遞質(zhì)釋放，復(fù)刻頂刊研究技術(shù)體系，覆蓋分子 - 細(xì)胞 - 行為全鏈條，賦能學(xué)習(xí)記憶與神經(jīng)疾病研究，助您高效產(chǎn)出高水平成果！

參考文獻(xiàn)：Woo J, Uprety A, Reid DJ, Chang I, Ketema Samuel A, de Carvalho Schuch H, Swain CC, Ostroumov A. Dynamic changes in chloride homeostasis coordinate midbrain inhibitory network activity during reward learning. Nat Commun. 2025 Dec 9;16(1):10903. doi: 10.1038/s41467-025-66838-xIF: 15.7 Q1 . PMID: 41365887; PMCID: PMC12689616.

創(chuàng)作聲明：本文是在原英文文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行解讀，存在觀點(diǎn)偏向性，僅作分享，請參考原文深入學(xué)習(xí)。
 

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