Innopsys激光共聚焦芯片掃描儀助力牙周炎機(jī)制研究
牙周炎是由多種微生物與宿主免疫反應(yīng)引起的牙周支持組織的慢性炎癥。牙齦上皮細(xì)胞借助模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識別包含核心致病菌牙齦卟啉單胞菌等口腔病原體，構(gòu)成了抵御感染的首要屏障。而最為關(guān)鍵的Toll 樣受體（Toll-like receptors, TLRs，TLR4 ）可感知病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），包括脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）和脂蛋白等。TLR4激活后會觸發(fā)下游信號通路（尤其是 NF-κB 通路），促進(jìn)IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子隨后放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加劇牙周組織損傷。
枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，能形成具有高度抵抗力的芽孢，耐受極端高溫、干燥及其他不利環(huán)境條件，可在胃酸、膽汁豐富的胃腸道以及復(fù)雜的口腔微生物生態(tài)系統(tǒng)等惡劣環(huán)境中存活。該菌可通過產(chǎn)生枯草菌素等多種抗菌肽發(fā)揮有益作用，具有抑制牙周致病菌生長的潛力。
在此前小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌 R0179可通過分泌含有中康酸的上清液，抑制牙齦卟啉單胞菌生長及生物膜的形成與成熟，進(jìn)而抑制該菌誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎。因此，需要闡明熱滅活枯草芽孢桿菌 R0179 是否通過 TLR 信號通路調(diào)控牙周炎癥，為牙周炎的預(yù)防和管理提供理論支持。
枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，能形成具有高度抵抗力的芽孢，耐受極端高溫、干燥及其他不利環(huán)境條件，可在胃酸、膽汁豐富的胃腸道以及復(fù)雜的口腔微生物生態(tài)系統(tǒng)等惡劣環(huán)境中存活。該菌可通過產(chǎn)生枯草菌素等多種抗菌肽發(fā)揮有益作用，具有抑制牙周致病菌生長的潛力。
在此前小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌 R0179可通過分泌含有中康酸的上清液，抑制牙齦卟啉單胞菌生長及生物膜的形成與成熟，進(jìn)而抑制該菌誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎。因此，需要闡明熱滅活枯草芽孢桿菌 R0179 是否通過 TLR 信號通路調(diào)控牙周炎癥，為牙周炎的預(yù)防和管理提供理論支持。
文章題目為“Inactivated Bacillus subtilis R0179 Inhibits Porphyromonas GingivalisInduced Gingival Inflammation Via TLR2/NF-κB Signaling in a Murine Model of Periodontitis”于2025年8月發(fā)表在Inflammation雜志，作者來自北京大學(xué)口腔預(yù)防學(xué)系國家口腔臨床研究中心。
研究人員為了評估牙齦卟啉單胞菌穿透牙齦上皮細(xì)胞的能力，將該菌與牙齦上皮細(xì)胞共培養(yǎng)2小時(shí)后收集樣本，進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。與對照組（C組）相比，牙齦卟啉單胞菌感染組（C+Pg 組）中，牙齦卟啉單胞菌可侵入牙齦上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并被吞噬體包裹形成吞噬小泡（圖1A中箭頭所示）。隨后使用qPCR（定量聚合酶鏈反應(yīng)）和Western blot（蛋白質(zhì)印跡法）檢測牙齦卟啉單胞菌刺激后牙齦上皮細(xì)胞中TLR（Toll 樣受體）的水平變化。
結(jié)果表明，與對照組（MOI=0 的牙齦卟啉單胞菌刺激組）相比，MOI=50 的牙齦卟啉單胞菌可顯著提高細(xì)胞中 TLR4 的蛋白和 mRNA水平。而牙齦卟啉單胞菌的刺激，是否會誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞中其他 TLR 的表達(dá)變化。研究人員以 MOI=50 的牙齦卟啉單胞菌刺激上皮細(xì)胞12小時(shí)發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌刺激可上調(diào) TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 及磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）的表達(dá)，并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放。為驗(yàn)證牙齦卟啉單胞菌刺激后促炎細(xì)胞因子的變化，研究人員通過細(xì)胞因子芯片檢測 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)，使用法國Innopsys激光共聚焦熒光掃描儀進(jìn)行熒光信號檢測及分析。結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌刺激可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達(dá)上調(diào)，該結(jié)果也驗(yàn)證了qPCR 實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)趨勢（如圖1）。
圖 1 牙齦卟啉單胞菌侵入牙齦上皮細(xì)胞并激活牙齦上皮細(xì)胞中的多種 Toll 樣受體（TLR）及炎癥通路.
（A）透射電子顯微鏡圖像顯示，牙齦卟啉單胞菌與牙齦上皮細(xì)胞共培養(yǎng) 2 小時(shí)后被細(xì)胞內(nèi)化的情況。（B）采用 qPCR（定量聚合酶鏈反應(yīng)）和 Western blot（蛋白質(zhì)印跡法），分析不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的牙齦卟啉單胞菌刺激牙齦上皮細(xì)胞 12 小時(shí)后，TLR4 的表達(dá)水平。（C）采用 qPCR 和 Western blot，分析感染復(fù)數(shù)（MOI）為 50 的牙齦卟啉單胞菌在不同時(shí)間點(diǎn)刺激牙齦上皮細(xì)胞后，TLR4 的表達(dá)水平。（D）Western blot 分析上皮細(xì)胞中 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、NF-κB（核因子 κB）及磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）的蛋白表達(dá)水平。各組縮寫如下：對照組（C 組）、牙齦卟啉單胞菌刺激組（C+Pg 組）。（E）qPCR 分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、白細(xì)胞介素 - 1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素 - 6（IL-6）及腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）的信使核糖核酸（mRNA）水平。（F）代表性細(xì)胞因子芯片膜圖像顯示 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的分泌表達(dá)情況。其中，POS-1 和 POS-2 為陽性對照孔。（G）通過熒光強(qiáng)度對細(xì)胞因子芯片結(jié)果進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.005，*** 代表 P<0.001。
為探究枯草芽孢桿菌 R0179 是否能逆轉(zhuǎn)牙齦卟啉單胞菌刺激誘導(dǎo)的 TLR、下游 p-NF-κB 及促炎細(xì)胞因子表達(dá)變化，研究人員通過 Western blot、qPCR 和抗體芯片實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。與單獨(dú)牙齦卟啉單胞菌感染組（Pg組）相比，枯草芽孢桿菌 R0179（MOI=50）共刺激組顯著降低了TLR2、TLR4 及 p-NF-κB 的蛋白水平，但對 TLR1 和 TLR6 的蛋白水平無顯著影響。qPCR 結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌 R0179 處理可下調(diào)牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的TLR2、TLR4、IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的 mRNA 水平，對 TLR1 和 TLR6 的 mRNA 水平無顯著影響。此外，枯草芽孢桿菌 R0179 還能下調(diào)牙齦卟啉單胞菌刺激的牙齦上皮細(xì)胞分泌 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的水平。熒光芯片檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 qPCR 實(shí)驗(yàn)中觀察到的細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)變化趨勢（圖2）。
圖 2 枯草芽孢桿菌 R0179 減輕牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙齦上皮細(xì)胞中 Toll 樣受體（TLR）/ 磷酸化核因子 κB（p-NF-κB）激活及炎癥反應(yīng).（A）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、NF-κB 及 p-NF-κB 的蛋白表達(dá)水平。各組縮寫如下：牙齦卟啉單胞菌刺激組（Pg 組）、牙齦卟啉單胞菌 + 枯草芽孢桿菌 R0179 刺激組（Pg+B. subtilis 組）。（B）定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、白細(xì)胞介素 - 1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素 - 6（IL-6）及腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）的信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)水平。（C）代表性細(xì)胞因子芯片圖像顯示 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的分泌情況。（D）通過熒光強(qiáng)度對細(xì)胞因子芯片結(jié)果進(jìn)行定量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.005，*** 代表 P<0.001。
為驗(yàn)證枯草芽孢桿菌 R0179 在體內(nèi)調(diào)控牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)炎癥的機(jī)制，研究人員開展了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。對上頜組織的蘇木精 - 伊紅（H&E）染色結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌刺激會加重牙齦炎癥，而枯草芽孢桿菌 R0179 處理可減輕該菌誘導(dǎo)的牙齦炎癥程度。與對照組（C 組）相比，牙齦卟啉單胞菌刺激組（C+Pg 組）中 TLR2、TLR4、p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達(dá)升高；而枯草芽孢桿菌 R0179 處理組（C+Pg+B.subtilis 組）可抑制牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的 TLR2、TLR4、p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達(dá)。此外，TLR2 受體激動劑處理可拮抗枯草芽孢桿菌 R0179 的作用，提高 p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達(dá)，而 TLR4 受體激動劑處理無顯著影響。
本研究探討了枯草芽孢桿菌 R0179 對牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用，系統(tǒng)評估了牙齦卟啉單胞菌和枯草芽孢桿菌 R0179 處理后，牙齦上皮細(xì)胞中 Toll 樣受體（TLRs）、磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）及下游促炎細(xì)胞因子表達(dá)的變化。研究結(jié)果不僅證實(shí)了牙齦卟啉單胞菌在牙周炎發(fā)病過程中誘導(dǎo)牙齦炎癥的作用，還揭示了枯草芽孢桿菌 R0179 可能通過抑制 TLR2/NF-κB 通路，減輕牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)揭示，熱滅活枯草芽孢桿菌 R0179 有望成為牙周炎管理中的一種潛在輔助治療手段。
原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s10753-025-02348-8
Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏恢敝铝τ谏镝t(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。Innoscan系列掃描儀，采用先進(jìn)的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時(shí)進(jìn)行多通道熒光檢測。不僅有效降低了熒光光漂白現(xiàn)象以及信號損失，還可以有效縮短掃描時(shí)間。在基因組和蛋白組表達(dá)，基因突變，SNP檢測，CGH，細(xì)菌病毒檢測，腫瘤特異性標(biāo)志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應(yīng)用。
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