蛋白表達(dá)和功能異常調(diào)控可極大地改變細(xì)胞生理學(xué)并導(dǎo)致許多病理生理狀況如癌癥、炎癥性疾病和神經(jīng)退行性疾病等。內(nèi)源性蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)表達(dá)由從頭合成和降解速率的平衡來控制。靶向蛋白質(zhì)降解（Targeted Protein Degradation，TPD）以劑量和時(shí)間依賴性方式通過蛋白酶體對(duì)致病靶蛋白進(jìn)行降解。從目前藥物研發(fā)進(jìn)展來看，靶向蛋白降解的概念提供了革命性的藥物開發(fā)機(jī)會(huì)，預(yù)計(jì)將帶來現(xiàn)代小分子藥物研發(fā)的轉(zhuǎn)變。

在靶向蛋白降解領(lǐng)域，蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Western Blot，WB）是觀察細(xì)胞中濃度依賴性蛋白質(zhì)降解的經(jīng)典方法。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡非常耗費(fèi)資源，需要多個(gè)洗滌步驟和長(zhǎng)孵育時(shí)間才能產(chǎn)生高質(zhì)量的印跡，導(dǎo)致技術(shù)操作復(fù)雜、通量低、定量不準(zhǔn)和重復(fù)性差等劣勢(shì)，難以推動(dòng)選擇性誘導(dǎo)、快速和可持續(xù)性的蛋白質(zhì)降解療法的快速發(fā)展。

根據(jù)藥物研發(fā)需求，工業(yè)界迫切需要建立高效、靈敏、可量化和可重現(xiàn)的蛋白質(zhì)降解技術(shù)平臺(tái)，滿足不同通量和不同研發(fā)階段需求。目前全球領(lǐng)先的靶向蛋白質(zhì)降解藥物研發(fā)公司基本建立了高低通量結(jié)合、篩選和驗(yàn)證一體化的研發(fā)平臺(tái)。下面文章一窺行業(yè)領(lǐng)先的藥物公司平臺(tái)建設(shè)思路。
SLAS Discovery：C4 Tx團(tuán)隊(duì)總結(jié)加速靶向蛋白降解療法開發(fā)和優(yōu)化的高通量技術(shù)
本文總結(jié)了靶向蛋白降解領(lǐng)域最常采用的從低通量到高通量的幾種不同方法。詳細(xì)說明了傳統(tǒng)Western blot、基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的Digital Western Blot（ProteinSimple）、高通量流式細(xì)胞術(shù)（HTFC）、AlphaLISA SureFire技術(shù)、時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)技術(shù)和Nano-Glo HiBiT技術(shù)。
Digital Western Blot技術(shù)

Digital WB技術(shù)是傳統(tǒng)WB實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的高效替代方案。使用該技術(shù)，可在同一根毛細(xì)管中完成樣品分離、捕獲、固定、免疫檢測(cè)和定量分析，從而實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)WB的所有實(shí)驗(yàn)步驟（包括蛋白質(zhì)上樣、分離、免疫印跡、洗滌、檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析）自動(dòng)化，有效提高蛋白質(zhì)表達(dá)定量結(jié)果的精確性和重復(fù)性。全自動(dòng)Digital WB技術(shù)顯著地縮短了樣本檢測(cè)時(shí)間到3小時(shí)，直接采集化學(xué)發(fā)光或熒光信號(hào)值，利用數(shù)字化信號(hào)峰面積來表征蛋白含量，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的可視化精準(zhǔn)定量分析。ProteinSimple旗下具有系列的Digital WB系統(tǒng)，從25到96個(gè)樣本通量，可滿足靶向蛋白降解藥物研發(fā)過程中對(duì)中低通量檢測(cè)需求。

本技術(shù)可相對(duì)和絕對(duì)定量檢測(cè)目的蛋白豐度，適用于內(nèi)源性的或未修飾靶蛋白分析，如果抗體表位不受干擾，也可檢測(cè)修飾的標(biāo)記過的蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)WB相比，Digital WB可實(shí)現(xiàn)高分子量蛋白質(zhì)可靠捕獲和定量分析如BRD4案例。同時(shí)，需要樣本量少，只需要3 μL上樣量，特別適用于細(xì)胞或降解劑有限的條件下，96孔板中收集處理過的細(xì)胞可滿足檢測(cè)需求。除了自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化之外，批次數(shù)據(jù)差異CV值較低，重復(fù)性好。軟件符合21 CFR Part11，數(shù)據(jù)全程可記錄。這些優(yōu)勢(shì)使其成為工業(yè)領(lǐng)域蛋白表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)配置。
 

高通量流式細(xì)胞術(shù)（HTFC）和In-Cell Western (ICW)
流式細(xì)胞技術(shù)可分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平，技術(shù)進(jìn)步已使流式可作為中高通量篩選方法來輔助藥物發(fā)現(xiàn)。緊湊型流式細(xì)胞儀可檢測(cè)96孔板中細(xì)胞配體或蛋白質(zhì)的不同熒光強(qiáng)度。本質(zhì)上，高通量流式細(xì)胞術(shù)一次檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞，提供單個(gè)細(xì)胞信號(hào)。而ICW對(duì)孔內(nèi)所有細(xì)胞進(jìn)行批量讀取。兩種方法使用比率熒光讀數(shù)來提高重現(xiàn)性和降低標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)而提高整體數(shù)據(jù)質(zhì)量。與傳統(tǒng)流式比，這兩種技術(shù)方案需要更少的樣本體積和檢測(cè)抗體可有效降低成本。但無法根據(jù)蛋白質(zhì)分子量參數(shù)來區(qū)分特異性和非特異性信號(hào)。
 

AlphaLISA SureFire技術(shù)

AlphaScreen是一種多功能的基于微珠相互靠近實(shí)驗(yàn)技術(shù)，基于生物分子的相互作用，可測(cè)定各種分析物包括標(biāo)記的或內(nèi)源性蛋白。本技術(shù)提高了檢測(cè)靈活性，微珠種類被設(shè)計(jì)識(shí)別各種不同的工程化蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或AlphaLISA每個(gè)微珠能包被針對(duì)目標(biāo)蛋白不同表位的特異性抗體。當(dāng)與同一蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，Alpha供體和受體微珠會(huì)靠近，采用680nm近紅外光激發(fā)，供體微珠導(dǎo)致單線態(tài)氧分子釋放。單線態(tài)氧的產(chǎn)生本身不足以產(chǎn)生信號(hào)，但當(dāng)受體微珠靠近時(shí)，會(huì)引發(fā)能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生放大的熒光信號(hào)。AlphaLISA SureFire技術(shù)采用改進(jìn)光譜特性的微珠，只能進(jìn)行終點(diǎn)分析，需要細(xì)胞裂解來觀察感興趣蛋白質(zhì)信號(hào)。對(duì)于時(shí)效性降解曲線，可通過多個(gè)高通量篩選細(xì)胞培養(yǎng)板在不同時(shí)間點(diǎn)裂解來實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)優(yōu)勢(shì)是有助于更快地優(yōu)化、自動(dòng)化和小型化，適用于化合物常規(guī)和高通量篩選�？蓽p少實(shí)際操作時(shí)間和信號(hào)讀取需要的總時(shí)間，加速藥物發(fā)現(xiàn)。具有飛克級(jí)靈敏度和 4-5 log 寬動(dòng)態(tài)范圍，使其適合于細(xì)胞內(nèi)、分泌或膜結(jié)合蛋白檢測(cè)。
 

對(duì)于靶向蛋白質(zhì)降解的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，384孔板可顯著縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。使用合適的抗體，通過使用針對(duì)靶蛋白翻譯后修飾的抗體來區(qū)分靶標(biāo)蛋白。例如使用特異性識(shí)別磷酸化蛋白的抗體直接評(píng)估具有自磷酸化活性激酶的化合物BiDAC抑制和降解影響，可與總蛋白（磷酸化和未磷酸化）測(cè)量值進(jìn)行比較。獲得這兩個(gè)數(shù)據(jù)可能會(huì)提高降解劑與抑制劑前體區(qū)分機(jī)制的理解，進(jìn)一步了解目標(biāo)蛋白調(diào)節(jié)對(duì)表型影響。

盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)有一些局限性。Alpha 微珠價(jià)格昂貴且對(duì)環(huán)境光高度敏感，需要在暗室環(huán)境添加實(shí)驗(yàn)試劑，上機(jī)前孵育期間盡可能避免在光線下長(zhǎng)時(shí)間暴露。此外，讀板機(jī)溫度會(huì)影響單線態(tài)氧的生成和擴(kuò)散速率，每攝氏度可高達(dá)10%。為了最大限度地減少批次間差異，實(shí)驗(yàn)微孔板和讀板機(jī)應(yīng)保持在溫度良好可控環(huán)境中。最后需要注意過渡金屬可導(dǎo)致單線態(tài)氧猝滅效應(yīng)。

時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)實(shí)驗(yàn)

TR-FRET實(shí)驗(yàn)可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平變化，有助于高效快速的靶向蛋白質(zhì)降解領(lǐng)域的藥物發(fā)現(xiàn)。與AlphaLISA SureFire 技術(shù)類似，TR-FRET 是一種直接的均質(zhì)混合和讀取夾心免疫分析方法，信號(hào)檢測(cè)前不需多次洗滌步驟。通過量化兩種熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體之間的比率信號(hào)來確定蛋白降解水平，這些抗體結(jié)合同一蛋白質(zhì)上的兩個(gè)不同表位，采用供體和受體熒光團(tuán)標(biāo)記。
 

TR-FRET是終點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，需要細(xì)胞裂解來觀察檢測(cè)感興趣蛋白質(zhì)的信號(hào)。如蛋白降解動(dòng)力學(xué)曲線，必須使用多個(gè)高通量篩選細(xì)胞板并行設(shè)計(jì)TR-FRET實(shí)驗(yàn)，以便裂解細(xì)胞并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后添加檢測(cè)抗體。將這些數(shù)據(jù)疊加可提供DC50、Emax偏移以及時(shí)效曲線。對(duì)于生物標(biāo)志物分析，重要的是兩種抗體使用不同表位與同一蛋白質(zhì)結(jié)合，以啟用 FRET 信號(hào)，同時(shí)將背景信號(hào)降至最低。與Alpha 技術(shù)一樣，該方法可用于測(cè)量目標(biāo)蛋白質(zhì)翻譯后的抑制，從而可對(duì)通路抑制以及總蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量。也可區(qū)別癌癥樣本突變體和正常組織中相同蛋白質(zhì)野生型具有選擇性的降解劑。本技術(shù)需要購買高質(zhì)量特異性抗體，長(zhǎng)期藥物發(fā)現(xiàn)工作時(shí)，TR-FRET 分析每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)成本可能是該技術(shù)的最大缺點(diǎn)，盡管成本可通過批量定制標(biāo)記抗體降低。TR-FRET實(shí)驗(yàn)的靈活性、適應(yīng)性和可轉(zhuǎn)移性具有優(yōu)勢(shì)。一旦針對(duì)某個(gè)細(xì)胞系靶蛋白的 HTRF方法建立，通常很容易轉(zhuǎn)移到表達(dá)相同蛋白質(zhì)的其他細(xì)胞系中。HTRF技術(shù)具有寬動(dòng)態(tài)范圍和信號(hào)穩(wěn)定，而無需擔(dān)心環(huán)境光的猝滅效應(yīng)。

Nano-Glo HiBiT技術(shù)

Nano-Glo HiBiT技術(shù)是一種高通量靶向蛋白質(zhì)降解藥物篩選系統(tǒng)。本技術(shù)基于分成兩部分互補(bǔ)NanoLuc熒光素酶系統(tǒng)，11個(gè)氨基酸的HiBiT標(biāo)簽和 17.6 kD LgBiT多肽。采用 CRISPR基因編輯技術(shù)將11個(gè)氨基酸的 HiBiT標(biāo)簽引入到編碼目標(biāo)蛋白基因內(nèi)，或設(shè)計(jì)為可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或慢病毒感染的重組DNA表達(dá)載體，兩種方式都可實(shí)現(xiàn)將標(biāo)簽與感興趣目的蛋白相連。加入特有的裂解檢測(cè)試劑，HiBiT會(huì)自發(fā)的與檢測(cè)試劑中與HiBiT互補(bǔ)的多肽LgBiT結(jié)合，二者結(jié)合后可形成有催化功能的NanoLuc 熒光素酶，可催化底物產(chǎn)生明亮的發(fā)光信號(hào)。該信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞裂解物中的 HiBiT 標(biāo)記蛋白含量成正比。

本技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度線性范圍有幾個(gè)數(shù)量級(jí)，產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)可穩(wěn)定數(shù)小時(shí)，因此適用于蛋白質(zhì)降解劑藥物發(fā)現(xiàn)階段的高通量篩選。將HiBiT標(biāo)簽基因編輯敲入到感興趣的蛋白質(zhì)序列中，并生成穩(wěn)定表達(dá) HiBiT 標(biāo)簽?zāi)康牡鞍椎募?xì)胞系，整個(gè)實(shí)驗(yàn)開發(fā)時(shí)間至少需要3-4周。如需要挑取高表達(dá)HiBiT信號(hào)的單細(xì)胞克隆，則這個(gè)系統(tǒng)開發(fā)時(shí)間額外增加2-3周。與不需要基因編輯開發(fā)表達(dá)HiBiT細(xì)胞系技術(shù)相比，開發(fā)時(shí)間長(zhǎng)是這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)。然而，一旦產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)的具有足夠信號(hào)的細(xì)胞克隆或細(xì)胞群，操作只需加樣、直接均勻混合和讀取檢測(cè)，比較簡(jiǎn)單。

HiBiT 技術(shù)也可進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)蛋白降解檢測(cè)。LgBiT蛋白通過慢病毒轉(zhuǎn)染到已經(jīng)表達(dá)HiBiT標(biāo)記的目標(biāo)蛋白細(xì)胞中，同時(shí)表達(dá)HiBiT和LgBiT標(biāo)簽，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中重組發(fā)光NanoBiT酶都存在，通過與特定底物作用來檢測(cè)信號(hào)隨時(shí)間變化值。作為單一的非裂解試劑添加步驟，持續(xù)幾分鐘到幾小時(shí)到幾天時(shí)間內(nèi)實(shí)時(shí)測(cè)量目的蛋白質(zhì)降解，所以這種方法檢測(cè)板和HiBiT試劑成本方面更具成本效益，但長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)需要配置自動(dòng)化系統(tǒng)。
 

 

 

 

通過CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因座特異性敲入或慢病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)，靶蛋白表達(dá)為一種具有 FKBP12F36V 突變體的嵌合體。dTAG-13等 dTAG 化合物由一個(gè)高選擇FKBP12F36V 配體與 E3 連接酶配體連接組成，該配體在融合蛋白和 E3 連接酶之間形成一個(gè)三元復(fù)合體，從而引起靶蛋白多聚泛素化和降解，dTAG-13 已被用來檢測(cè)和驗(yàn)證癌癥新靶點(diǎn)。

下圖利用dTAG降解劑處理表達(dá)FKBP12F36V 融合蛋白，評(píng)估探索劑量依賴性降解反應(yīng)。利用Digital WB檢測(cè)蛋白降解水平，最高劑量500nM下觀察到最大降解。在這種情況下，與 5nM dTAG-13 處理相比，用相應(yīng)的陰性對(duì)照 (dTAG-13-NEG) 處理似乎略微降低了目標(biāo)蛋白水平。A圖CRBN募集dTAG降解劑dTAG-13，B圖是VHL募集的dTAG降解劑dTAGV-1。與 dTAG-13處理一樣，觀察到劑量依賴性降解，最高測(cè)試劑量 (500 nM) 下觀察到最大降解。右圖條帶圖和峰面積圖定量數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)dTAG降解劑之間的靈敏度差異。與 dTAG-13相比，用dTAGV-1處理后的降解更敏感，在這種情況下，dTAGV-1將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的首選降解劑。
 

采用dTAGV-1處理野生型FKBP12和FKBP12F36V 靶標(biāo)2細(xì)胞，Digital WB可直接反應(yīng)融合蛋白與野生型分子量變化，同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)dTAGV-1劑量依賴性降解反應(yīng)。
 

通過以上案例，可知傳統(tǒng)免疫印跡方法重復(fù)性較差、定量不準(zhǔn)確和操作時(shí)間長(zhǎng)等技術(shù)限制，很難滿足蛋白泛素化水平檢測(cè)和靶標(biāo)驗(yàn)證的精準(zhǔn)定量需求。Digital WB技術(shù)是基于毛細(xì)管電泳的快速定量免疫學(xué)檢測(cè)方法，可檢測(cè)靶蛋白和泛素化蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而準(zhǔn)確反應(yīng)靶向蛋白降解研究過程量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。Digital WB技術(shù)可靈敏地、快速地、可重復(fù)性確認(rèn)內(nèi)源性蛋白降解，以確保與初步篩選實(shí)驗(yàn)中高通量技術(shù)獲得一致性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是RPOTAC技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建的必備技術(shù)。已被GSK、Pfizer、Arvinas、Kymera therapeutics、C4 therapeutics，藥明康德和康龍化成等領(lǐng)先RPOTAC藥物研發(fā)和服務(wù)公司采用。

PROTAC 是 Arvinas, Inc. 的注冊(cè)商標(biāo)，BiDAC是C4 therapeutics的注冊(cè)商標(biāo)。其他商標(biāo)和注冊(cè)商標(biāo)是其各自所有者的財(cái)產(chǎn)，本文引自如下文獻(xiàn)：

1. Jeffrey R. Simard, Linda Lee etc. (2021). High-Throughput Quantitative Assay Technologies for Accelerating the Discovery and Optimization of Targeted Protein Degradation Therapeutics. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 503–517

2. Ellen F. Vieux, Roman V. Agafonov etc. (2021). A Method for Determining the Kinetics of Small-Molecule-Induced Ubiquitination. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 547–559