延髓GABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在大鼠下唇副交感神經(jīng)反射性血管舒張中的作用
來(lái)自北海道健康科學(xué)大學(xué)牙科學(xué)院So Kawakamia研究團(tuán)隊(duì)，在《BRAIN RESEARCH》期刊發(fā)表了一項(xiàng)題為“延髓 GABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在下唇副交感反射性血管舒張中的作用”研究。該研究旨在明確三叉神經(jīng)脊髓核（Vsp）和下涎核（ISN）中γ-氨基丁酸（GABA）及其受體在調(diào)節(jié)舌神經(jīng)（LN）誘發(fā)的大鼠下唇副交感神經(jīng)反射性血管舒張中的作用。
摘要
在口腔頜面區(qū)域，三叉神經(jīng)區(qū)域口腔頜面結(jié)構(gòu)受到傷害性刺激時(shí)，會(huì)引發(fā)副交感神經(jīng)反射性血管舒張，這一過(guò)程通過(guò)三叉神經(jīng)脊髓核（Vsp）和下/上涎核（ISN/SSN）實(shí)現(xiàn)。然而，這些核團(tuán)內(nèi)抑制性突觸輸入所涉及的神經(jīng)遞質(zhì)此前尚未被描述。異氟醚、七氟醚和氟烷等揮發(fā)性麻醉劑的GABA能作用可抑制這種副交感神經(jīng)反射性血管舒張，提示延髓GABA能機(jī)制通過(guò)激活GABA受體對(duì)副交感神經(jīng)反射發(fā)揮抑制作用。本研究的目的是確定Vsp和ISN中的GABA及GABA受體在調(diào)節(jié)舌神經(jīng)（LN）誘發(fā)的下唇副交感神經(jīng)反射性血管舒張中的作用。在烏拉坦麻醉（1g/kg）下，記錄頸迷走神經(jīng)-交感神經(jīng)切斷大鼠經(jīng)舌神經(jīng)電刺激后下唇血流的變化。向Vsp或ISN微注射GABA可明顯且可逆地減弱LN誘發(fā)的副交感神經(jīng)反射性血管舒張。向Vsp或ISN微注射GABA_A受體選擇性激動(dòng)劑毒蕈堿或GABA_B受體選擇性激動(dòng)劑巴氯芬，可明顯且不可逆地降低這種反射性血管舒張，且預(yù)先向Vsp或ISN微注射相應(yīng)受體選擇性拮抗劑GABA_A受體選擇性拮抗劑甲碘荷包牡丹堿或GABA_B受體選擇性拮抗劑CGP-35348可減弱這些作用。單獨(dú)向Vsp或ISN微注射這些拮抗劑，對(duì)該反射性血管舒張無(wú)明顯影響。此外，向Vsp或ISN微注射毒蕈堿和巴氯芬的混合物（0.3μl/位點(diǎn)），也可明顯降低這種反射性血管舒張。這些結(jié)果表明，延髓GABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)Vsp和ISN中的GABA_A和GABA_B受體抑制大鼠下唇的副交感神經(jīng)反射性血管舒張。
實(shí)驗(yàn)材料與儀器
實(shí)驗(yàn)材料
異氟醚、泮庫(kù)溴銨、鹽酸利多卡因、烏拉坦、甲碘荷包牡丹堿、CGP-35348、毒蕈堿氫溴酸鹽、巴氯芬、六甲銨、滂胺天藍(lán)染料（2%）、戊巴比妥鈉、生理鹽水、4%多聚甲醛、0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、30%蔗糖、硫堇染料、其他化學(xué)試劑
實(shí)驗(yàn)儀器
立體定位儀、電刺激器、、隔離單元、Statham壓力傳感器、麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀、呼吸機(jī)、四通道圖表記錄儀、冷凍切片機(jī)、微量注射套管、同心單極電極、顯微鏡載玻片、微量操作器、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
動(dòng)物準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)選用80只體重350-480g的成年雄性Wistar大鼠，以異氟醚誘導(dǎo)麻醉后，皮下注射烏拉坦（100mg/100g體重），并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)需要補(bǔ)充，以維持基礎(chǔ)麻醉狀態(tài)。對(duì)大鼠進(jìn)行股靜脈插管以便給藥，股動(dòng)脈插管并連接至Statham壓力傳感器以監(jiān)測(cè)全身動(dòng)脈血壓（SABP）。麻醉后的動(dòng)物進(jìn)行氣管插管，靜脈注射泮庫(kù)溴銨（初始劑量0.6mg/kg，持續(xù)補(bǔ)充0.4mg/kg/h）使其癱瘓，通過(guò)氣管套管用50%空氣和50%氧氣的混合物進(jìn)行人工通氣。呼吸機(jī)設(shè)置為潮氣量1.5ml/100g體重，呼吸頻率30-40次/分鐘，用麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)呼氣末二氧化碳濃度，維持在35-40mmHg，同時(shí)用加熱墊將直腸溫度維持在37-38℃。通過(guò)捏夾腳趾約2s觀察全身動(dòng)脈血壓是否反射性升高，以判斷麻醉深度是否足夠，若不足則靜脈間歇注射100mg/kg烏拉坦。所有實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行任何刺激前，均雙側(cè)切斷頸部迷走神經(jīng)和頸上交感神經(jīng)干，以分別消除迷走神經(jīng)對(duì)心血管系統(tǒng)的反射作用和交感縮血管纖維對(duì)口腔頜面區(qū)域的影響。
下唇血流測(cè)量
使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)下唇血流。將探頭放置在下唇上，不施加任何組織壓力，血流變化通過(guò)測(cè)量圖表上的反應(yīng)高度進(jìn)行評(píng)估，并持續(xù)顯示在四通道圖表記錄儀上。
空心圓：向 Vsp（B 圖）或 ISN（C 圖）微量注射蠅蕈醇的效應(yīng)；
實(shí)心圓：向 Vsp（B 圖）或 ISN（C 圖）微量注射碘甲硫酸荷包牡丹堿預(yù)處理 30 分鐘后，再向 Vsp（B 圖）或 ISN（C 圖）微量注射蠅蕈醇的效應(yīng)。
舌神經(jīng)電刺激
使用雙極電極電刺激舌神經(jīng)（LN）的中樞切斷端，以誘發(fā)下唇副交感神經(jīng)反射性血管舒張。
Vsp和ISN中下唇血管舒張位點(diǎn)的識(shí)別
將動(dòng)物以平顱位固定在立體定位儀上，進(jìn)行部分開(kāi)顱手術(shù)。除尖端外均用搪瓷絕緣的同心單極電極通過(guò)引導(dǎo)套管插入，降低刺激電極直至電刺激引發(fā)最大血管舒張反應(yīng)，確定Vsp或ISN中的下唇血管舒張位點(diǎn)。通過(guò)引導(dǎo)套管插入注射套管，向Vsp或ISN微注射0.3μl/位點(diǎn)的4%利多卡因，以確認(rèn)LN刺激引發(fā)的血管舒張反應(yīng)是否通過(guò)Vsp或ISN介導(dǎo)。
自主神經(jīng)節(jié)阻斷劑的使用
使用膽堿能自主神經(jīng)節(jié)阻斷劑六甲銨驗(yàn)證ISN電刺激引發(fā)的下唇血管舒張的自主性，并將其作為ISN套管植入正確的指標(biāo)。
延髓GABA能藥物微注射
在利多卡因微注射可明顯降低同側(cè)LN刺激引發(fā)的血管舒張反應(yīng)的位點(diǎn)，向Vsp或ISN微注射0.3μl/位點(diǎn)的GABA、毒蕈堿或巴氯芬。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，向Vsp或ISN微注射毒蕈堿和巴氯芬的混合物。另外，在微注射毒蕈堿或巴氯芬前30min，向Vsp或ISN微注射0.3μl的甲碘荷包牡丹堿或CGP-35348。在LN誘發(fā)的反應(yīng)從利多卡因的影響中完全恢復(fù)后20-30min開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，將微注射特定藥物后獲得的LN誘發(fā)反應(yīng)幅度表示為給藥前記錄的對(duì)照反應(yīng)的百分比。
組織學(xué)檢查
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，向Vsp和ISN的注射位點(diǎn)微注射0.3μl的滂胺天藍(lán)染料進(jìn)行標(biāo)記。然后給所有大鼠靜脈輸注過(guò)量戊巴比妥鈉（約100mg），通過(guò)升主動(dòng)脈灌注200ml生理鹽水，隨后立即灌注500ml 4%多聚甲醛的0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）。取出腦干和上頸脊髓，在4℃下保存在含有30%蔗糖的冷緩沖液中4-7天。之后，用冷凍切片機(jī)切成50μm厚的切片，收集在0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，將切片掛載在MAS涂層顯微鏡載玻片上，并用硫堇染色，以檢查電刺激和微注射位點(diǎn)。
統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，隨后進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)比較。使用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較甲碘荷包牡丹堿+毒蕈堿組與毒蕈堿組、CGP-35348+巴氯芬組與巴氯芬組之間的差異。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究結(jié)果表明，三叉神經(jīng)脊髓核（Vsp）和下涎核（ISN）中的GABA_A和GABA_B受體均能抑制下唇的副交感神經(jīng)反射性血管舒張�？谇活M面區(qū)域的副交感神經(jīng)反射性血管舒張通過(guò)位于Vsp和ISN中的GABA_A和GABA_B受體接受GABA能抑制輸入。這些發(fā)現(xiàn)為通過(guò)作用于GABA受體的麻醉劑調(diào)節(jié)口腔頜面血流提供了新的相關(guān)信息，并可能對(duì)口腔頜面手術(shù)中揮發(fā)性麻醉劑的使用具有重要意義。GABA介導(dǎo)的血流減少對(duì)于在全身麻醉下進(jìn)行口腔頜面手術(shù)時(shí)減少出血似乎具有相當(dāng)重要的作用，因?yàn)閾]發(fā)性麻醉劑可減少口腔頜面區(qū)域受到傷害性手術(shù)刺激時(shí)引發(fā)的副交感神經(jīng)反射性血管舒張，但仍需進(jìn)一步研究明確揮發(fā)性麻醉劑是否通過(guò)這些機(jī)制對(duì)口腔頜面區(qū)域的副交感神經(jīng)反射性血管舒張發(fā)揮抑制作用。
摘要
在口腔頜面區(qū)域，三叉神經(jīng)區(qū)域口腔頜面結(jié)構(gòu)受到傷害性刺激時(shí)，會(huì)引發(fā)副交感神經(jīng)反射性血管舒張，這一過(guò)程通過(guò)三叉神經(jīng)脊髓核（Vsp）和下/上涎核（ISN/SSN）實(shí)現(xiàn)。然而，這些核團(tuán)內(nèi)抑制性突觸輸入所涉及的神經(jīng)遞質(zhì)此前尚未被描述。異氟醚、七氟醚和氟烷等揮發(fā)性麻醉劑的GABA能作用可抑制這種副交感神經(jīng)反射性血管舒張，提示延髓GABA能機(jī)制通過(guò)激活GABA受體對(duì)副交感神經(jīng)反射發(fā)揮抑制作用。本研究的目的是確定Vsp和ISN中的GABA及GABA受體在調(diào)節(jié)舌神經(jīng)（LN）誘發(fā)的下唇副交感神經(jīng)反射性血管舒張中的作用。在烏拉坦麻醉（1g/kg）下，記錄頸迷走神經(jīng)-交感神經(jīng)切斷大鼠經(jīng)舌神經(jīng)電刺激后下唇血流的變化。向Vsp或ISN微注射GABA可明顯且可逆地減弱LN誘發(fā)的副交感神經(jīng)反射性血管舒張。向Vsp或ISN微注射GABA_A受體選擇性激動(dòng)劑毒蕈堿或GABA_B受體選擇性激動(dòng)劑巴氯芬，可明顯且不可逆地降低這種反射性血管舒張，且預(yù)先向Vsp或ISN微注射相應(yīng)受體選擇性拮抗劑GABA_A受體選擇性拮抗劑甲碘荷包牡丹堿或GABA_B受體選擇性拮抗劑CGP-35348可減弱這些作用。單獨(dú)向Vsp或ISN微注射這些拮抗劑，對(duì)該反射性血管舒張無(wú)明顯影響。此外，向Vsp或ISN微注射毒蕈堿和巴氯芬的混合物（0.3μl/位點(diǎn)），也可明顯降低這種反射性血管舒張。這些結(jié)果表明，延髓GABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)Vsp和ISN中的GABA_A和GABA_B受體抑制大鼠下唇的副交感神經(jīng)反射性血管舒張。
實(shí)驗(yàn)材料與儀器
實(shí)驗(yàn)材料
異氟醚、泮庫(kù)溴銨、鹽酸利多卡因、烏拉坦、甲碘荷包牡丹堿、CGP-35348、毒蕈堿氫溴酸鹽、巴氯芬、六甲銨、滂胺天藍(lán)染料（2%）、戊巴比妥鈉、生理鹽水、4%多聚甲醛、0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、30%蔗糖、硫堇染料、其他化學(xué)試劑
實(shí)驗(yàn)儀器
立體定位儀、電刺激器、、隔離單元、Statham壓力傳感器、麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀、呼吸機(jī)、四通道圖表記錄儀、冷凍切片機(jī)、微量注射套管、同心單極電極、顯微鏡載玻片、微量操作器、Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀
Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
動(dòng)物準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)選用80只體重350-480g的成年雄性Wistar大鼠，以異氟醚誘導(dǎo)麻醉后，皮下注射烏拉坦（100mg/100g體重），并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)需要補(bǔ)充，以維持基礎(chǔ)麻醉狀態(tài)。對(duì)大鼠進(jìn)行股靜脈插管以便給藥，股動(dòng)脈插管并連接至Statham壓力傳感器以監(jiān)測(cè)全身動(dòng)脈血壓（SABP）。麻醉后的動(dòng)物進(jìn)行氣管插管，靜脈注射泮庫(kù)溴銨（初始劑量0.6mg/kg，持續(xù)補(bǔ)充0.4mg/kg/h）使其癱瘓，通過(guò)氣管套管用50%空氣和50%氧氣的混合物進(jìn)行人工通氣。呼吸機(jī)設(shè)置為潮氣量1.5ml/100g體重，呼吸頻率30-40次/分鐘，用麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)呼氣末二氧化碳濃度，維持在35-40mmHg，同時(shí)用加熱墊將直腸溫度維持在37-38℃。通過(guò)捏夾腳趾約2s觀察全身動(dòng)脈血壓是否反射性升高，以判斷麻醉深度是否足夠，若不足則靜脈間歇注射100mg/kg烏拉坦。所有實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行任何刺激前，均雙側(cè)切斷頸部迷走神經(jīng)和頸上交感神經(jīng)干，以分別消除迷走神經(jīng)對(duì)心血管系統(tǒng)的反射作用和交感縮血管纖維對(duì)口腔頜面區(qū)域的影響。
下唇血流測(cè)量
使用Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)下唇血流。將探頭放置在下唇上，不施加任何組織壓力，血流變化通過(guò)測(cè)量圖表上的反應(yīng)高度進(jìn)行評(píng)估，并持續(xù)顯示在四通道圖表記錄儀上。
Omegawave FLO-C1激光多普勒血流儀
（A）向脊髓三叉神經(jīng)核（Vsp）微量注射氫溴酸蠅蕈醇，對(duì)舌神經(jīng)中樞切斷端電刺激所誘發(fā)的左血流量（LBF）增加的影響的代表性示例。
（a1）向 Vsp 微量注射蠅蕈醇的效應(yīng)。
（a2）向 Vsp 微量注射碘甲硫酸荷包牡丹堿預(yù)處理 30 分鐘后，再向 Vsp 微量注射蠅蕈醇的效應(yīng)。
（B、C）向 Vsp（B 圖）或下牙槽神經(jīng)（ISN）（C 圖）微量注射氫溴酸蠅蕈醇，對(duì) LN 中樞切斷端電刺激誘發(fā) LBF 增加的影響的時(shí)間進(jìn)程。
（a2）向 Vsp 微量注射碘甲硫酸荷包牡丹堿預(yù)處理 30 分鐘后，再向 Vsp 微量注射蠅蕈醇的效應(yīng)。
（B、C）向 Vsp（B 圖）或下牙槽神經(jīng)（ISN）（C 圖）微量注射氫溴酸蠅蕈醇，對(duì) LN 中樞切斷端電刺激誘發(fā) LBF 增加的影響的時(shí)間進(jìn)程。
空心圓：向 Vsp（B 圖）或 ISN（C 圖）微量注射蠅蕈醇的效應(yīng)；
實(shí)心圓：向 Vsp（B 圖）或 ISN（C 圖）微量注射碘甲硫酸荷包牡丹堿預(yù)處理 30 分鐘后，再向 Vsp（B 圖）或 ISN（C 圖）微量注射蠅蕈醇的效應(yīng)。
舌神經(jīng)電刺激
使用雙極電極電刺激舌神經(jīng)（LN）的中樞切斷端，以誘發(fā)下唇副交感神經(jīng)反射性血管舒張。
Vsp和ISN中下唇血管舒張位點(diǎn)的識(shí)別
將動(dòng)物以平顱位固定在立體定位儀上，進(jìn)行部分開(kāi)顱手術(shù)。除尖端外均用搪瓷絕緣的同心單極電極通過(guò)引導(dǎo)套管插入，降低刺激電極直至電刺激引發(fā)最大血管舒張反應(yīng)，確定Vsp或ISN中的下唇血管舒張位點(diǎn)。通過(guò)引導(dǎo)套管插入注射套管，向Vsp或ISN微注射0.3μl/位點(diǎn)的4%利多卡因，以確認(rèn)LN刺激引發(fā)的血管舒張反應(yīng)是否通過(guò)Vsp或ISN介導(dǎo)。
自主神經(jīng)節(jié)阻斷劑的使用
使用膽堿能自主神經(jīng)節(jié)阻斷劑六甲銨驗(yàn)證ISN電刺激引發(fā)的下唇血管舒張的自主性，并將其作為ISN套管植入正確的指標(biāo)。
延髓GABA能藥物微注射
在利多卡因微注射可明顯降低同側(cè)LN刺激引發(fā)的血管舒張反應(yīng)的位點(diǎn)，向Vsp或ISN微注射0.3μl/位點(diǎn)的GABA、毒蕈堿或巴氯芬。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，向Vsp或ISN微注射毒蕈堿和巴氯芬的混合物。另外，在微注射毒蕈堿或巴氯芬前30min，向Vsp或ISN微注射0.3μl的甲碘荷包牡丹堿或CGP-35348。在LN誘發(fā)的反應(yīng)從利多卡因的影響中完全恢復(fù)后20-30min開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，將微注射特定藥物后獲得的LN誘發(fā)反應(yīng)幅度表示為給藥前記錄的對(duì)照反應(yīng)的百分比。
組織學(xué)檢查
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，向Vsp和ISN的注射位點(diǎn)微注射0.3μl的滂胺天藍(lán)染料進(jìn)行標(biāo)記。然后給所有大鼠靜脈輸注過(guò)量戊巴比妥鈉（約100mg），通過(guò)升主動(dòng)脈灌注200ml生理鹽水，隨后立即灌注500ml 4%多聚甲醛的0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）。取出腦干和上頸脊髓，在4℃下保存在含有30%蔗糖的冷緩沖液中4-7天。之后，用冷凍切片機(jī)切成50μm厚的切片，收集在0.1M磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中，將切片掛載在MAS涂層顯微鏡載玻片上，并用硫堇染色，以檢查電刺激和微注射位點(diǎn)。
統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析，隨后進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)比較。使用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較甲碘荷包牡丹堿+毒蕈堿組與毒蕈堿組、CGP-35348+巴氯芬組與巴氯芬組之間的差異。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究結(jié)果表明，三叉神經(jīng)脊髓核（Vsp）和下涎核（ISN）中的GABA_A和GABA_B受體均能抑制下唇的副交感神經(jīng)反射性血管舒張�？谇活M面區(qū)域的副交感神經(jīng)反射性血管舒張通過(guò)位于Vsp和ISN中的GABA_A和GABA_B受體接受GABA能抑制輸入。這些發(fā)現(xiàn)為通過(guò)作用于GABA受體的麻醉劑調(diào)節(jié)口腔頜面血流提供了新的相關(guān)信息，并可能對(duì)口腔頜面手術(shù)中揮發(fā)性麻醉劑的使用具有重要意義。GABA介導(dǎo)的血流減少對(duì)于在全身麻醉下進(jìn)行口腔頜面手術(shù)時(shí)減少出血似乎具有相當(dāng)重要的作用，因?yàn)閾]發(fā)性麻醉劑可減少口腔頜面區(qū)域受到傷害性手術(shù)刺激時(shí)引發(fā)的副交感神經(jīng)反射性血管舒張，但仍需進(jìn)一步研究明確揮發(fā)性麻醉劑是否通過(guò)這些機(jī)制對(duì)口腔頜面區(qū)域的副交感神經(jīng)反射性血管舒張發(fā)揮抑制作用。
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