腦組織三光子高分辨率成像技術(shù)1300納米波長下實(shí)現(xiàn)超過90%高透射率
三光子激發(fā)顯微鏡作為一種先進(jìn)的生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)對深層組織的高分辨率觀測，但傳統(tǒng)機(jī)械調(diào)焦方式存在體積大、響應(yīng)慢等局限。本研究提出了一種基于電潤濕效應(yīng)的可調(diào)諧液體透鏡，利用室溫離子液體（RTIL）與非極性液體1-苯基-1-環(huán)己烯（PCH）的組合，實(shí)現(xiàn)了在1300納米波長下超過90%的高透射率，并成功應(yīng)用于三光子顯微鏡系統(tǒng)，在對小鼠腦切片成像中展現(xiàn)出與機(jī)械掃描相媲美的性能。這一技術(shù)為微型化、低功耗的深層組織成像設(shè)備提供了新思路。
本研究的核心成果由Samuel D. Gilinsky、Diane N. Jung、Greg L. Futia、Mo Zohrabi、Tarah A. Welton、Omkar D. Supekar、Emily A. Gibson、Diego Restrepo、Victor M. Bright和Juliet T. Gopinath共同完成，論文題為“Tunable liquid lens for three-photon excitation microscopy”發(fā)表在《Biomedical Optics Express》。
重要發(fā)現(xiàn)
01近紅外兼容液體組合的特性突破
三光子顯微鏡通常使用1300納米或1700納米的近紅外光作為激發(fā)源，以提升組織穿透深度。然而，傳統(tǒng)電潤濕透鏡中的去離子水在近紅外區(qū)域有強(qiáng)吸收（如1300納米時(shí)透射率僅77.84%），導(dǎo)致光熱效應(yīng)和設(shè)備失效風(fēng)險(xiǎn)。為此，研究團(tuán)隊(duì)篩選出室溫離子液體N-丙基-N-甲基吡咯烷雙（氟磺酰）亞胺（N-Pr-Me-Pyrr(SO2F)2）與PCH的組合。通過紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)測量，這兩種液體在1.1毫米光程下于1300納米波長的透射率分別達(dá)到93.06%和90.35%，顯著優(yōu)于水基溶液。此外，團(tuán)隊(duì)還通過棱鏡耦合器測得二者在1300納米下的折射率分別為1.433和1.556，折射率差達(dá)0.123，為透鏡調(diào)焦提供了充足的光學(xué)功率基礎(chǔ)。這一液體組合不僅解決了近紅外吸收問題，還通過密度匹配（密度差0.349 g/cm³）降低了重力對液面的影響，提升了設(shè)備穩(wěn)定性。
研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了直徑4毫米的圓柱形電潤濕透鏡，其內(nèi)壁依次鍍有氧化銦錫（ITO）電極、聚對二甲苯（Parylene HT）介電層和疏水性Cytop涂層。底部接地電極窗通過微加工技術(shù)集成環(huán)形金電極，并與玻璃管環(huán)氧鍵合。透鏡腔內(nèi)填充等體積（約35微升）的RTIL和PCH液體，通過施加電壓改變液-液界面曲率。實(shí)驗(yàn)表明，該透鏡的接觸角可在0-60伏電壓下從133度調(diào)至48度，對應(yīng)焦距范圍覆蓋-22.95毫米至+23.39毫米，涵蓋發(fā)散和會聚兩種工作模式。通過擬合Lippmann-Young方程，團(tuán)隊(duì)計(jì)算出液-液界面張力為3.193 mN/m，且在32.5伏以上出現(xiàn)接觸角飽和現(xiàn)象。這種寬范圍調(diào)諧能力為軸向掃描提供了關(guān)鍵支持。
03動態(tài)響應(yīng)與成像集成實(shí)驗(yàn)
液體透鏡的響應(yīng)速度直接影響成像效率。由于RTIL粘度較高（52.7 cP），階躍電壓驅(qū)動下液面穩(wěn)定需11.64秒。但通過施加1.75倍過驅(qū)動電壓（持續(xù)50毫秒），穩(wěn)定時(shí)間縮短至5.34秒。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將透鏡集成至三光子顯微鏡光路中：1300納米飛秒激光源經(jīng)擴(kuò)束后入射至透鏡，再通過掃描振鏡和25倍水浸物鏡聚焦到樣品。熒光和諧波信號由光電倍增管采集。實(shí)驗(yàn)以Thy1-GCaMP6f轉(zhuǎn)基因小鼠的300微米厚腦切片為樣本，對比了電潤濕調(diào)焦與機(jī)械平移物鏡的成像效果。結(jié)果顯示，在20-60伏電壓范圍內(nèi)，透鏡可實(shí)現(xiàn)約32微米的軸向掃描，且第二諧波（血管）、第三諧波（髓鞘）和綠色熒光蛋白（神經(jīng)元）通道的圖像分辨率與機(jī)械掃描相當(dāng)（半高全寬約10微米）。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
本研究首要突破了傳統(tǒng)水基電潤濕透鏡在近紅外波段吸收強(qiáng)的技術(shù)瓶頸。通過采用室溫離子液體，團(tuán)隊(duì)解決了高功率激光下的熱損傷問題，使透鏡可耐受三光子顯微鏡所需的兆瓦級峰值功率。這一創(chuàng)新將電潤濕技術(shù)的適用波長擴(kuò)展至1600納米以上，為深組織成像提供了硬件基礎(chǔ)。
技術(shù)層面，團(tuán)隊(duì)首次將N-Pr-Me-Pyrr(SO2F)2與PCH組合用于電潤濕透鏡，其折射率差（0.123）和透射率（>90%）均優(yōu)化至實(shí)用水平。相較于早期離子液體組合，該方案密度匹配度更高（密度差0.349 g/cm³），顯著降低了液面重力變形風(fēng)險(xiǎn)。此外，透鏡采用全透明ITO電極和微型化封裝，整體尺寸僅立方厘米級，重量不足10克，遠(yuǎn)超機(jī)械掃描模塊的緊湊性。
在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該透鏡的價(jià)值體現(xiàn)在活體神經(jīng)成像場景中。例如，頭戴式微型顯微鏡需快速軸向掃描以觀測不同皮層層的神經(jīng)元活動。本研究演示的32微米掃描范圍足以覆蓋小鼠皮質(zhì)多層結(jié)構(gòu)，且無需移動物鏡，避免了機(jī)械振動引起的圖像漂移。結(jié)合三光子技術(shù)對顱骨穿透的優(yōu)勢，未來可望用于自由活動動物的長期腦功能研究，為神經(jīng)退行性疾病或記憶機(jī)制研究提供新工具。
總結(jié)與展望
本研究成功開發(fā)了一種近紅外兼容的電潤濕液體透鏡，通過離子液體與非極性液體的組合，實(shí)現(xiàn)了高透射率、大調(diào)諧范圍的焦點(diǎn)控制，并在三光子顯微鏡中驗(yàn)證了其成像能力。該技術(shù)不僅解決了傳統(tǒng)機(jī)械掃描的體積和速度限制，還為微型化生物醫(yī)學(xué)成像設(shè)備奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。展望未來，研究團(tuán)隊(duì)指出可通過優(yōu)化非極性液體選擇（如提升界面張力）進(jìn)一步縮短響應(yīng)時(shí)間，并探索電壓波形整形策略以抑制液面振蕩。此外，該透鏡在自由空間光通信、激光雷達(dá)等近紅外應(yīng)用中也具潛力，有望推動自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)在多領(lǐng)域的交叉創(chuàng)新。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Gilinsky SD, Jung DN, Futia GL, Zohrabi M, Welton TA, Supekar OD, Gibson EA, Restrepo D, Bright VM, Gopinath JT. Tunable liquid lens for three-photon excitation microscopy. Biomed Opt Express. 2024 Apr 24;15(5):3285-3300.
DOI:10.1364/BOE.516956.
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