本文要點：本研究設(shè)計合成了一種可被一氧化氮高效激活的D-π-A-π-D型有機小分子CTBA。該分子在可見光區(qū)具有吸收和發(fā)射特性，當(dāng)與腫瘤微環(huán)境中過量一氧化氮反應(yīng)后，可轉(zhuǎn)化為新型結(jié)構(gòu)分子CTBT，在808 nm激發(fā)下展現(xiàn)出卓越的NIR-II熒光、光動力及光熱性能。值得注意的是，這種可激活探針首次實現(xiàn)三大關(guān)鍵特性的融合：（1）用于深組織可視化的NIR-II成像能力；（2）按需激活響應(yīng)功能進行治療；（3）光動力-光熱協(xié)同效應(yīng)，這是此類集成系統(tǒng)的首次報道。憑借其"開關(guān)式"特性，該探針顯著降低了成像背景噪聲及光療過程對正常組織的損傷。通過CTBA與PS1000-PEG2000自組裝構(gòu)建的CTBA-NPs，在體外和體內(nèi)實驗中均實現(xiàn)了高度精準(zhǔn)高效的腫瘤診療，為設(shè)計激活型多功能NIR-II熒光探針提供了創(chuàng)新策略。
 

方案1.（a）CTBA NPs制備方案（b）可激活NIR-II熒光CTBA NPs成像引導(dǎo)PDT/PTT協(xié)同治療的機制

為獲得具有NO響應(yīng)的NIR-II發(fā)射的熒光團，研究者將苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺作為電子受體與電子供體環(huán)戊烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩（CPDT）及噻吩單元結(jié)合，構(gòu)建出D-π-A-π-D型有機熒光分子CTBA。作為電子供體，CPDT在結(jié)合合適電子受體時，可使探針在激光激發(fā)下實現(xiàn)光動力或光熱效應(yīng)，其高電子密度特性還能確保熒光團在近紅外II區(qū)發(fā)射。同時引入的富電子噻吩單元作為π橋，增強了電子離域化。CTBA的合成路線如圖1a所示。當(dāng)受體與一氧化氮反應(yīng)后，CTBA可轉(zhuǎn)化為新型結(jié)構(gòu)CTBT，進而引發(fā)光物理性質(zhì)變化（圖1b）。首先通過光譜表征發(fā)現(xiàn)：CTBA在300-550 nm范圍內(nèi)吸收（峰值385 nm），發(fā)射光譜覆蓋450-750 nm（最大發(fā)射560 nm）。當(dāng)苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺被一氧化氮氧化形成更強受體5H-[1,2,3]三唑并[4,5-f]-2,1,3-苯并噻二唑時，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）過程增強，導(dǎo)致能隙減小并實現(xiàn)顯著紅移。因此向CTBA溶液加入NO后，吸收光譜紅移至600-900 nm，發(fā)射光譜則轉(zhuǎn)移至NIR-II窗口（800-1200 nm），并伴隨強NIR-II熒光（圖1d）。MALDI-TOF-MS證實了CTBA與NO反應(yīng)后三唑衍生物CTBT的形成（圖1e），在1143處觀察到特征質(zhì)譜峰。

圖1. CTBA的設(shè)計、合成及對NO的響應(yīng)特性

為探究探針與一氧化氮反應(yīng)前后光譜性質(zhì)變化的機理，采用密度泛函理論（DFT）計算分析了CTBA與CTBT的幾何構(gòu)型及電子特性。如圖1f所示，最高占據(jù)分子軌道（HOMO）主要分布于整個共軛骨架，而最低未占分子軌道（LUMO）則集中于受體部分，表明兩者均存在明顯的供體-受體相互作用和分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移。值得注意的是，由于CTBT受體具有更強的吸電子能力，其LUMO電子較CTBA更集中于受體區(qū)域，導(dǎo)致LUMO能級從-2.11 eV降至-3.11 eV。同時伴隨HOMO能級部分升高，最終使CTBT的HOMO-LUMO能隙減小至1.32 eV。更窄的能隙更易實現(xiàn)長波長吸收，這與實驗觀測到的顯著光譜紅移現(xiàn)象一致。這些光譜性質(zhì)變化表明，CTBA可作為理想的NIR-II熒光探針用于一氧化氮檢測。

圖2. CTBA-NPs的制備、光物理特性及對一氧化氮的響應(yīng)

為提高生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的生物相容性，采用納米共沉淀法通過PS1000-PEG2000包封 CTBA構(gòu)建CTBA-NPs。隨后對其光物理性質(zhì)進行檢測。如圖2a所示，CTBA-NPs的光譜與CTBA相似，吸收范圍300-550 nm，發(fā)射范圍500-750 nm。圖2b顯示CTBA-NPs的水合粒徑約為96 nm。掃描電鏡（SEM）圖像表明其形貌呈均勻球形。在水中儲存30天后，CTBA-NPs的粒徑、吸收及熒光光譜均未發(fā)生顯著變化，證實其具有優(yōu)異的膠體穩(wěn)定性（圖2c-e）。此外，CTBA-NPs在生物條件下的穩(wěn)定性也得到評估。7天內(nèi)其光譜特性及粒徑均未發(fā)生顯著變化，進一步證實其出色的系統(tǒng)穩(wěn)定性。

圖3. CTBA-NPs的光動力和光熱性能

如Jablonski分子能級圖（圖3a）所示，除輻射躍遷途徑產(chǎn)生的熒光外，非輻射躍遷與系間竄越（ISC）途徑也可能產(chǎn)生有效的光熱或光動力效應(yīng)。因此，本文評估了CTBA-NPs與一氧化氮作用前后的光治療能力。首先，為檢測近紅外光激發(fā)產(chǎn)生的活性氧（ROS），采用2′,7′-二氯二氫熒光素（DCFH-DA）作為指示劑。在ROS存在時，DCFH-DA會被氧化為高熒光強度的2,7-二氯熒光素（DCF）。如圖3b、c所示，未與一氧化氮反應(yīng)的CTBA-NPs在808 nm激光照射下幾乎不產(chǎn)生ROS（因其在808 nm處吸收可忽略），但當(dāng)其與NO完全反應(yīng)生成產(chǎn)物CTBT后，2.5 μM濃度下即可觀察到大量ROS生成；濃度達10 μM時，ROS產(chǎn)量可達空白組的70倍。這表明CTBA-NPs經(jīng)一氧化氮激活后具有顯著的光動力效應(yīng)。

此外，對CTBA-NPs的光熱能力進行評估（圖3d-f）。未激活狀態(tài)下，808 nm激光照射未引發(fā)明顯熱效應(yīng)；但經(jīng)NO激活后，10 μM、25 μM和50 μM CTBA-NPs溶液溫度在10分鐘內(nèi)分別升高12.2°C、17.4°C和22.1°C。通過圖3g的溫度變化曲線及圖3h擬合公式計算，其光熱轉(zhuǎn)換效率η達22.3%。光熱穩(wěn)定性測試顯示（圖3i），經(jīng)過五次激光開關(guān)循環(huán)，溶液溫度升降趨勢未出現(xiàn)明顯波動，證實NO激活的CTBA-NPs具備良好的光熱穩(wěn)定性。綜上，體外實驗表明CTBA-NPs在NO激活前幾乎無光治療效應(yīng)，而激活后在808 nm激光照射下表現(xiàn)出優(yōu)異的光動力與光熱協(xié)同治療效果。這種"開關(guān)式"策略使其在腫瘤治療應(yīng)用中更具可控性。

圖4. CTBA納米粒的體外生物相容性及抗腫瘤作用

首先通過MTT法評估了CTBA-NPs的體外生物相容性。如圖4a所示，當(dāng)CTBA-NPs濃度在0-100μM范圍內(nèi)時，細(xì)胞存活率均保持在80%以上，表明CTBA-NPs具有優(yōu)異的體外生物相容性，可進一步用于體內(nèi)應(yīng)用。隨后評估了CTBA-NPs在HepG2細(xì)胞中的攝取性能。圖4b、c顯示，通過共聚焦顯微鏡（CLSM）可清晰觀察到時間依賴性的細(xì)胞攝取現(xiàn)象：CTBA-NPs在8小時即可被HepG2細(xì)胞明顯攝取，12小時完成內(nèi)化，說明其能高效進入細(xì)胞，從而進一步探索光療研究。鑒于CTBA-NPs可被一氧化氮有效激活，本文在不同條件下對癌細(xì)胞的毒性進行測試。圖4d、e表明：當(dāng)CTBA-NPs未被NO激活時，即使808 nm激光照射下HepG2與H22細(xì)胞，存活率仍高于80%；同樣，NO激活但無激光照射時，對細(xì)胞的毒性也較低。這證實CTBA-NPs在缺乏NO和激光的條件下不會損傷細(xì)胞，確保其對正常組織的生物安全性。反之，當(dāng)CTBA-NPs濃度達50 μM且被NO激活后，808 nm激光照射下兩種癌細(xì)胞存活率分別降至~23%與~21%，激活態(tài)的CTBA-NPs在激光作用下產(chǎn)生顯著的光動力與光熱效應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞損傷凋亡。

為驗證該結(jié)果，研究者進行了鈣黃綠素AM/碘化丙啶（calcein AM/PI）雙染熒光成像實驗。圖4f顯示，僅當(dāng)CTBA-NPs被NO激活并接受激光照射時才能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，與MTT結(jié)果一致。進一步通過DCFH-DA檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)現(xiàn)（圖4g），NO激活聯(lián)合激光照射組產(chǎn)生明顯綠色熒光，證實激活態(tài)CTBA-NPs可通過光動力作用殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，該可激活光療系統(tǒng)對正常細(xì)胞具有優(yōu)異生物相容性，同時展現(xiàn)出強大的腫瘤細(xì)胞殺傷能力。

圖5. CTBA-NPs 的 NIR-II 窗口中的體內(nèi)腫瘤成像

由于深層組織穿透能力對近紅外二區(qū)（NIR-II）成像至關(guān)重要，在開展活體成像前，首先評估了CTBA-NPs的組織穿透性能。如圖5a所示，當(dāng)CTBA-NPs與一氧化氮完全反應(yīng)后，可產(chǎn)生明亮的NIR-II熒光。在未覆蓋雞胸肉組織的條件下，調(diào)節(jié)濃度后的CTBA-NPs與吲哚菁綠（ICG）在相同成像條件下亮度相當(dāng)。但隨著組織厚度逐漸增加，ICG信號強度顯著下降，同時信背比（SBR）降低、半峰寬（FWHM）增大，成像分辨率明顯劣化（圖5b、c）。相比之下，當(dāng)組織厚度小于4 mm時，CTBA-NPs的熒光信號仍能保持SBR＞2；即使厚度增至6 mm，仍可觀測到其特征熒光信號�？傮w而言，CTBA-NPs在NIR-II成像中的SBR與FWHM指標(biāo)均優(yōu)于ICG，證實其適用于理想的活體NIR-II成像。

隨后將CTBA-NPs應(yīng)用于小鼠腫瘤NIR-II成像。通過增強滲透滯留（EPR）效應(yīng)，CTBA-NPs可富集于腫瘤部位，并被腫瘤微環(huán)境中過量的一氧化氮激活。激活產(chǎn)物在808 nm激光照射下呈現(xiàn)顯著NIR-II熒光。如圖5d、e所示，12小時即可在腫瘤部位觀察到明顯熒光發(fā)射，隨著CTBA-NPs持續(xù)富集及一氧化氮激活作用增強，72小時內(nèi)熒光強度逐漸提升。值得注意的是，CTBA-NPs的NIR-II熒光具有一氧化氮特異性激活特性，成像過程中背景信號幾乎不可見，表明該納米熒光探針能實現(xiàn)靈敏、精準(zhǔn)的腫瘤NIR-II成像。進一步通過瘤內(nèi)注射脂多糖（LPS）溶液刺激炎癥產(chǎn)生更多一氧化氮后，熒光強度顯著增強，再次驗證其激活機制。

最后對處死小鼠進行離體NIR-II成像。如圖5f-i所示，得益于激活成像的特異性，小鼠主要器官均未觀察到明顯NIR-II熒光信號。LPS刺激后，其胃部和腸道出現(xiàn)微弱熒光，可能源自腫瘤部位激活的CTBA-NPs經(jīng)消化系統(tǒng)代謝所致。但由于該信號強度遠低于腫瘤組織，不會影響活體成像的準(zhǔn)確性。這些結(jié)果表明，CTBA-NPs憑借一氧化氮特異性激活能力，可成為兼具腫瘤診斷與治療潛力的優(yōu)異NIR-II成像劑。

圖6. CTBA納米粒的體內(nèi)抗腫瘤作用

為驗證CTBA-NPs的光治療潛力，隨后在H22荷瘤小鼠模型中評估了其體內(nèi)抗腫瘤效果。如圖6a所示，將H22細(xì)胞皮下接種于BALB/C小鼠體內(nèi)，待腫瘤體積生長至200±50 mm³時，將荷瘤小鼠隨機分為六組（每組4只）：(1)PBS處理組；(2)PBS聯(lián)合激光組；(3)CTBA-NPs處理組；(4)CTBA-NPs聯(lián)合激光組（圖6b）。如圖6c、d所示，CTBA-NPs被腫瘤微環(huán)境中過量的一氧化氮激活后，在808 nm激光照射下表現(xiàn)出顯著的光熱效應(yīng)，腫瘤部位溫度可升高超過20°C，這與體外光熱實驗結(jié)果一致。從接種腫瘤起每2天測量各組小鼠體重與腫瘤體積。圖6e顯示各組小鼠體重?zé)o顯著差異，而圖6f-h表明G1、G2、G3組的腫瘤快速生長且無抑制效果，說明單獨使用激光或CTBA-NPs均無法殺傷腫瘤細(xì)胞。值得注意的是，當(dāng)CTBA-NPs與808 nm激光協(xié)同治療時，腫瘤體積顯著縮小甚至完全消失。該現(xiàn)象歸因于被一氧化氮激活的CTBA-NPs在激光作用下產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的ROS，并發(fā)揮顯著光熱效應(yīng)。此外，通過不同組別治療后腫瘤組織的H&E染色進一步評估了CTBA-NPs的抗腫瘤能力。圖6i顯示治療組腫瘤組織在光激發(fā)下呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞核損傷，表明細(xì)胞發(fā)生凋亡與壞死。綜上，該可激活光療系統(tǒng)展現(xiàn)出顯著的腫瘤消融能力與卓越的生物安全性。

總之，本文設(shè)計并合成了一種可被一氧化氮激活的D-π-A-π-D型近紅外二區(qū)診療一體化熒光探針，采用高電子密度給電子體CPDT與一氧化氮響應(yīng)基團苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺受體結(jié)合，獲得小分子熒光團CTBA，再通過PS1000–PEG2000包裹形成CTBA-NPs納米顆粒。當(dāng)CTBA-NPs在腫瘤微環(huán)境中被過量一氧化氮激活時，受體部分的鄰苯二胺基團會轉(zhuǎn)化為電子密度更低的三唑結(jié)構(gòu)，使探針發(fā)射波長顯著紅移至近紅外二區(qū)窗口；同時在808 nm激光照射下表現(xiàn)出顯著的光動力與光熱性能。該探針成功實現(xiàn)了小鼠腫瘤的精準(zhǔn)近紅外二區(qū)成像及光動力/光熱協(xié)同治療，為可激活近紅外二區(qū)探針的設(shè)計開辟了新途徑，并為腫瘤精準(zhǔn)診斷與影像引導(dǎo)協(xié)同光療提供了新策略。

參考文獻

Zhang X, Li L, Ren Y, et al. Nitric oxide-activatable NIR-II organic small molecule for fluorescence imaging-guided synergistic photodynamic and photothermal therapy[J]. Chemical Science, 2025.

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