類器官是干細(xì)胞經(jīng)體外三維培養(yǎng)形成的 “微型器官”，結(jié)構(gòu)與功能貼近真實(shí)器官，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)胞系和動(dòng)物模型的局限，廣泛用于疾病建模、藥物篩選等領(lǐng)域。但是由于類器官本身不透明，且常規(guī)切片對(duì)結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生損害。最近組織透明化技術(shù)的發(fā)展，使類器官研究有了更大的進(jìn)步。借助組織透明化技術(shù)，可無(wú)損呈現(xiàn)類器官三維結(jié)構(gòu)與細(xì)胞分布，動(dòng)態(tài)追蹤其發(fā)育及功能響應(yīng)，既提升研究精準(zhǔn)度與效率，也為疾病機(jī)制解析、個(gè)性化醫(yī)療提供關(guān)鍵支持。

2025 年，來(lái)自美國(guó)得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心、辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心等機(jī)構(gòu)的研究團(tuán)隊(duì)，在《Nature Communications》發(fā)表了題名為 “Cellular crosstalk mediated by TGF-β drives epithelial-mesenchymal transition in patient-derived multi-compartment biliary organoids”的研究論文。該團(tuán)隊(duì)不僅成功構(gòu)建了能精準(zhǔn)模擬人類膽道結(jié)構(gòu)與功能的多腔室膽道類器官（MBOs）模型，更借助這一模型，揭示了在新生兒膽道閉鎖（BA，一種致死性兒科膽管疾�。┲�，由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β（TGF-β）介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊，是驅(qū)動(dòng)膽管上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、引發(fā)膽道結(jié)構(gòu)缺陷與纖維化的關(guān)鍵致病通路。

研究的主要結(jié)果
1、模型構(gòu)建：多腔室膽道類器官（MBOs）的構(gòu)建與驗(yàn)證
將正常肝或 BA 患者肝來(lái)源的膽管上皮類器官細(xì)胞，與 HUVECs（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）、MSCs（間充質(zhì)干細(xì)胞）按特定比例（膽管上皮細(xì)胞 4.7×10⁵個(gè)、HUVECs 3.3×10⁵個(gè)、MSCs 1.0×10⁵個(gè)）混合，接種于基底膜提取物（BME）與內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（EGM）的混合基質(zhì)中，先經(jīng)擴(kuò)張培養(yǎng)基（EM）培養(yǎng) 5 天，再用膽管分化培養(yǎng)基（DM）培養(yǎng) 9 天，最終形成 3D 結(jié)構(gòu)的 MBOs（圖1）。

圖 1 MBO(多腔室膽道類器官)的構(gòu)建與檢測(cè)

a：MBO 構(gòu)建步驟示意圖（含細(xì)胞混合、擴(kuò)張培養(yǎng)、分化培養(yǎng)階段）；
b-c：培養(yǎng) 5 天、10 天、14 天后 MBOs 外層細(xì)胞層面積量化結(jié)果（5-10 天外層細(xì)胞層面積增長(zhǎng) 4 倍）及相位差顯微鏡下結(jié)構(gòu)變化；
d-e： 整體免疫染色顯示 MBOs 中 CK19⁺上皮細(xì)胞（紅色）、CD31⁺內(nèi)皮細(xì)胞（綠色）、VIM⁺間充質(zhì)細(xì)胞（白色）的分布，與 3 日齡小鼠肝外膽管解剖結(jié)構(gòu)高度一致；
g-h：PEGASOS 透明化處理后，免疫染色顯示 MBO 與 3-4 日齡小鼠肝外膽管中 EPCAM（白色）和 TROP2（紅色）的表達(dá)（MBO 中 PBGs 呈 TROP2 低表達(dá) / EPCAM⁺）；
i：FACS 分析結(jié)果（MBO 中 TROP2 低表達(dá) / EPCAM⁺的 PBG 細(xì)胞數(shù)量是單一上皮類器官（Mono）的 30 倍）；
j：免疫染色顯示 MBOs 中 SOX9（紅色）、SOX2（紅色）、CK19（綠色）和細(xì)胞核（藍(lán)色；DAPI）的信號(hào)分布（PBG 樣結(jié)構(gòu)表達(dá) SOX9、SOX2 等祖細(xì)胞標(biāo)志物）。

通過(guò)透明化后的 3D 成像，清晰觀察到 NC-MBOs（正常 MBOs）的分層結(jié)構(gòu)：外層 CK19⁺上皮細(xì)胞形成連續(xù)的膽管樣結(jié)構(gòu)，中央 CD31⁺內(nèi)皮細(xì)胞和 VIM⁺間充質(zhì)細(xì)胞形成支持網(wǎng)絡(luò)，PBGs（膽管周圍腺體）嵌入其中。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，僅膽管上皮細(xì)胞與 MSCs 共培養(yǎng)無(wú)法形成完整 MBO 結(jié)構(gòu)，僅與 HUVECs 共培養(yǎng)則無(wú)法形成類器官，證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞對(duì) MBO 構(gòu)建及 PBG 發(fā)育的必要性。

組織透明化一站式科研解決方案，找禮智生物！
隨著神經(jīng)科學(xué)的深入發(fā)展，越來(lái)越多的研究依賴于網(wǎng)絡(luò)化、整體化的檢測(cè)和觀察手段，因此組織透明化在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成為越來(lái)越重要的工具。PEGASOS作為一種獨(dú)特的透明化技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)在于軟硬組織都能透明，透明度高，熒光保護(hù)性好，操作簡(jiǎn)便，已發(fā)表文獻(xiàn)150+篇。

透明化試劑盒

禮智生物專業(yè)代理PEGASOS組織透明化試劑盒，并且能為您提供組織透明化一站式科研解決方案（光片顯微3D成像代拍），歡迎感興趣的老師同學(xué)聯(lián)系我們（聯(lián)系方式見(jiàn)文末）！

組織透明化后成像以及光片顯微鏡

2、機(jī)制發(fā)現(xiàn)：BA-MBOs 中 EMT 與 TGF-β 信號(hào)的異常激活
為解析 BA 的核心致病機(jī)制，研究通過(guò)單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）對(duì) BA-MBOs（BA 患者來(lái)源 MBOs）與 NC-MBOs 進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如下：
1.異常中間細(xì)胞群富集：BA-MBOs 中存在 3 個(gè)異常富集的 “中間細(xì)胞群”（Intermediate 1/2/4），分別高表達(dá) TGF-β 誘導(dǎo) EMT 的介導(dǎo)基因（如 LGALS1、IGFBP7）、ECM 重塑基因（如 LOX、FN1），且是 TGF-β 的主要分泌來(lái)源；

2.TGF-β3 信號(hào)過(guò)度激活：BA-MBOs 中間充質(zhì)細(xì)胞分泌的 TGF-β3 量是 NC-MBOs 的 4 倍，可通過(guò)激活上皮細(xì)胞的 SMAD2/3 通路，上調(diào) SNAI1、ZEB2 等 EMT 轉(zhuǎn)錄因子；

3.上皮細(xì)胞表型異常：EMT 激活導(dǎo)致 BA-MBOs 中上皮細(xì)胞失去極性，形成 “pan-CK⁺/VIM⁺混合細(xì)胞”，上皮極性標(biāo)志物 ZO1、E - 鈣黏蛋白表達(dá)分布異常，酸性黏蛋白分泌能力顯著下降（Alcian Blue 染色陽(yáng)性率僅為 NC-MBOs 的 1/5）。

圖 2 對(duì)類器官細(xì)胞的譜系分析

a-b：BA-MBO 與 NC-MBO 的相位差顯微鏡圖像及 CK19⁺上皮細(xì)胞數(shù)量量化（BA-MBOs 中 CK19⁺細(xì)胞數(shù)量減少 40%）；
c：免疫染色對(duì)比兩種類器官的 TGF-β3 表達(dá)（BA-MBOs 中 TGF-β3 染色強(qiáng)度是 NC-MBOs 的 4 倍）；
d：第 5 天和第 14 天 MBO 的 FACS 結(jié)果（第 14 天 BA-MBOs 中 pan-CK⁺/VIM⁺混合細(xì)胞數(shù)量是 NC-MBOs 的 2 倍，pan-CK⁺/VIM⁻上皮細(xì)胞數(shù)量減少 3 倍）；
e：scRNA-seq 的 UMAP 圖（按細(xì)胞類型著色，含上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及 5 個(gè)中間細(xì)胞群）；
f：中間細(xì)胞群的 MSigDB 通路富集結(jié)果（EMT、TGF-β 受體信號(hào)通路顯著富集）；
g：各細(xì)胞群在 MBO 中的比例（BA-MBOs 中 Intermediate 2/4 細(xì)胞群占比增加 2-3 倍）；
h：UMAP 圖中疊加的 EMT 評(píng)分（BA-MBOs 中中間細(xì)胞群 EMT 評(píng)分顯著高于 NC-MBOs）。
長(zhǎng)期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，將 MBOs 培養(yǎng)至 28 天時(shí)，NC-MBOs 仍維持完整上皮結(jié)構(gòu)，而 BA-MBOs 中 VIM⁺細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)張，上皮細(xì)胞體積減少約 3 倍，再現(xiàn)了 BA 患者膽道纖維化的進(jìn)展特征。

3、治療探索：TGF-β 抑制劑對(duì) BA 表型的逆轉(zhuǎn)作用既往恐懼經(jīng)歷促進(jìn)后續(xù)厭惡學(xué)習(xí)
體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 TGF-β 抑制劑 A8301 對(duì) BA 表型的逆轉(zhuǎn)效果，具體結(jié)果如下：
1.體外實(shí)驗(yàn)（BA-MBOs）：
（1）10μM A8301 處理后，BA-MBOs 中 pan-CK⁺/VIM⁺混合細(xì)胞數(shù)量減少 60%，pan-CK⁺/VIM⁻上皮細(xì)胞數(shù)量增加 2 倍；
（2）透明化 3D 成像顯示（圖3C），上皮層連續(xù)性恢復(fù)，CK19⁺細(xì)胞形成的表面積與 NC-MBOs 無(wú)顯著差異（p>0.05），PBGs 數(shù)量和大小分別增加 2.5 倍、3 倍；
（3）上皮功能恢復(fù)：ZO1、E - 鈣黏蛋白重新定位于細(xì)胞頂端，酸性黏蛋白分泌能力恢復(fù)至 NC-MBOs 的 80%。

2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（BA 模型小鼠）：
對(duì) RRV（恒河猴輪狀病毒）感染誘導(dǎo)的 BA 模型小鼠，腹腔注射 A8301（1mg/kg 體重 / 天），結(jié)果顯示：
（1）黃疸發(fā)生率從 80% 降至 25%，21 天存活率從 30% 提升至 75%；
（2）血清膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平分別降低 60%、55%；
（3）肝組織病理顯示，肝外膽管上皮完整性恢復(fù)，門靜脈區(qū)纖維化程度顯著減輕（Sirius Red 染色陽(yáng)性面積減少 50%）。

圖 3 抑制TGF-β的表達(dá)對(duì)BA 表型存在恢復(fù)作用

a：A8301 體外抑制 BA-MBOs 中 TGF-β 信號(hào)的流程示意圖（含藥物處理時(shí)間、濃度）；
b：FACS 定量第 14 天 A8301 處理后 MBOs 的膽管及間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)量；
c：A8301 處理后 ，PEGASOS透明化MBOs 的免疫染色圖像（CK19：紅，CD31：綠，VIM：白）及 CK19⁺結(jié)構(gòu)數(shù)量、PBG 樣結(jié)構(gòu)大小定量；
d-f：A8301 處理后 BA-MBOs 的 E - 鈣黏蛋白表達(dá)、ZO1 表達(dá)及 Alcian Blue 染色結(jié)果（黏液分泌能力顯著恢復(fù)）；
g-h：BA 患者與正常對(duì)照血清中 TGF-β1/2/3 及 INHBA 的表達(dá)水平（BA 患者血清 TGF-β3 含量是正常對(duì)照的 3 倍）。

研究總結(jié)
該研究通過(guò)構(gòu)建多腔室膽道類器官（MBOs）模型，首次在體外模擬了人類膽道的雙重上皮結(jié)構(gòu)（膽管上皮 + 膽管周圍腺體），并明確了 TGF-β 介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊在 BA 發(fā)病中的核心作用：
1.模型創(chuàng)新：MBOs 模型解決了傳統(tǒng)單一上皮類器官無(wú)法模擬膽道微環(huán)境的局限，可用于 BA 發(fā)病機(jī)制研究及藥物篩選；
2.機(jī)制突破：證實(shí) TGF-β3-SMAD2/3-EMT 通路是 BA 膽道結(jié)構(gòu)缺陷與纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)通路；
3.治療潛力：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí) TGF-β 抑制劑 A8301 可有效逆轉(zhuǎn) BA 表型，為 BA 的靶向治療提供了新方向。

該研究不僅為膽道疾病研究提供了更貼近生理狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)工具，也為 BA 的臨床轉(zhuǎn)化研究奠定了理論基礎(chǔ)，未來(lái)有望通過(guò) TGF-β 抑制劑聯(lián)合其他療法，改善 BA 患者的預(yù)后。

參考文獻(xiàn)
Ayabe H, DePasquale EAK, Amarachintha SP, et al. Cellular crosstalk mediated by TGF-β drives epithelial-mesenchymal transition in patient-derived multi-compartment biliary organoids. Nat Commun. 2025 Jul 17;16(1):6575. doi: 10.1038/s41467-025-61442-5. 

想要獲取本篇文獻(xiàn)的老師同學(xué)們，可以拉到文末掃碼添加禮智小客服哦！