殼聚糖含量的測(cè)定
1.1 方法原理
分光光度法
殼聚糖經(jīng)鹽酸水解生成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物。生色原與對(duì)二甲氨基苯甲醛在酸性條件下反應(yīng)生成紫紅色化合物，在波長(zhǎng)525nm處測(cè)定其吸光度，在一定濃度范圍內(nèi)，該化合物的吸光度與氨基葡萄糖濃度成正比，由此可以用分光光度法測(cè)定。
1.2試劑
所用試劑和溶液的配制，在未注明規(guī)格和配制方法時(shí)，均按HG/T3696規(guī)定執(zhí)行。高效液相色譜法用水為超純水，分光光度法用水為三級(jí)去離子水。
乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；三氯甲烷；濃鹽酸；氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品；無(wú)醛乙醇（95%以上）；乙酰丙酮；殼聚糖1（脫乙酰度80%～95%）；殼聚糖2（脫乙酰度大于95%）。
鹽酸溶液（1+1）：鹽酸與水體積比為1∶1。
鹽酸溶液（0.3mol/L）：量取鹽酸27mL，再加水稀釋至1L。
鹽酸溶液（8mol/L）：量取鹽酸680mL，再加水稀釋至1L。
氫氧化鈉溶液（10mol/L）：稱取氫氧化鈉400g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1L。
氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取氫氧化鈉40g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1L。
氫氧化鈉溶液（0.3mol/L）：稱取氫氧化鈉12g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1L。
PMP甲醇溶液（0.5mol/L）：稱取8.71g PMP，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中用甲醇定容。
磷酸二氫鉀溶液（0.1mol/L）：采用超純水配制，調(diào)節(jié)pH至6.7，過(guò)0.45μm水系微孔濾膜后備用（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
碳酸鈉溶液（0.5mol/L）：稱取碳酸鈉53g，置于500mL燒杯中，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中用水定容。
乙酰丙酮溶液：移取乙酰丙酮2.0mL，用碳酸鈉溶液（0.5mol/L）定容至50mL，于冰箱中放置過(guò)夜。
對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液：稱取對(duì)二甲氨基苯甲醛0.8g，溶于無(wú)醛乙醇15mL及濃鹽酸15mL中，混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00g/L）：稱取氨基葡萄糖鹽酸鹽0.100g，置于100mL燒杯中，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中用水定容。
氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）：移取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00g/L）2.00mL至100mL容量瓶中，用水定容（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
1.3儀器
紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，配1cm比色皿；電子分析天平。
1.4供試樣品
樣品來(lái)源于肥料生產(chǎn)企業(yè)的肥料產(chǎn)品。
1.5樣品前處理
1.5.1 試樣的制備
將固體樣品采用四分法縮分至約100g，將其迅速研磨至全部通過(guò)0.50mm孔徑試驗(yàn)篩（如樣品潮濕，可通過(guò)1.00mm孔徑試驗(yàn)篩），混合均勻，置于潔凈、干燥的容器中；液體樣品經(jīng)搖動(dòng)均勻后，迅速取出約100mL，置于潔凈、干燥的容器中。
1.5.2 試樣溶液的制備
稱取混合均勻的0.5～1g固體試樣或5～10g液體試樣（精確至0.0001g，以含殼聚糖200～400mg為佳），置于100mL容量瓶中，先加入1.0mL濃鹽酸，然后加入水溶解后定容。移取1.00mL溶液至水解管中，加入1.0mL濃鹽酸和8.0mL鹽酸溶液（1+1），封管后于100℃水解24h。水解完成后，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入氫氧化鈉溶液（10mol/L） 6mL后用鹽酸溶液（0.3mol/L）和氫氧化鈉溶液 （0.3mol/L）調(diào)節(jié)pH至7.0，然后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水定容。
1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分光光度法
分別移取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL置于7個(gè)具塞試管中，用水補(bǔ)充至5.00mL，該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液含氨基葡萄糖鹽酸鹽的量分別為0、10.0、 20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg。分別加入乙酰丙酮溶液1.00mL，混勻，置于沸水浴中（1min后蓋塞）放置25min，取出，用冰水迅速冷卻至室溫，加入無(wú)醛乙醇3.00mL，再加入對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液1.00mL，混勻，于60℃水浴中（5min后蓋塞） 放置1h，取出立即用冷水冷卻至室溫，在波長(zhǎng)525nm處，用1cm比色皿進(jìn)行比色，以含氨基葡萄糖鹽酸鹽0 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)零，讀取吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液含氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.8試樣溶液的測(cè)定
分光光度法
準(zhǔn)確移取試樣溶液1.00～5.00mL（含氨基葡萄糖鹽酸鹽10～100 μg）置于具塞試管中，用水補(bǔ)充至5.00mL，在與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液相同的條件下顯色、比色，以空白實(shí)驗(yàn)溶液調(diào)零，讀取吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量（μg）。在測(cè)定過(guò)程中，若試樣溶液在加入顯色劑之前有顏色，則應(yīng)于另一具塞試管中，加入相同體積的試樣溶液，除顯色階段用1.00mL鹽酸溶液 （1+1）代替對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液外，其余操作相同，測(cè)定吸光度，計(jì)算時(shí)扣除該吸光度。
分光光度法
殼聚糖經(jīng)鹽酸水解生成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖在堿性條件下與乙酰丙酮縮合形成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物。生色原與對(duì)二甲氨基苯甲醛在酸性條件下反應(yīng)生成紫紅色化合物，在波長(zhǎng)525nm處測(cè)定其吸光度，在一定濃度范圍內(nèi)，該化合物的吸光度與氨基葡萄糖濃度成正比，由此可以用分光光度法測(cè)定。
1.2試劑
所用試劑和溶液的配制，在未注明規(guī)格和配制方法時(shí)，均按HG/T3696規(guī)定執(zhí)行。高效液相色譜法用水為超純水，分光光度法用水為三級(jí)去離子水。
乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；三氯甲烷；濃鹽酸；氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品；無(wú)醛乙醇（95%以上）；乙酰丙酮；殼聚糖1（脫乙酰度80%～95%）；殼聚糖2（脫乙酰度大于95%）。
鹽酸溶液（1+1）：鹽酸與水體積比為1∶1。
鹽酸溶液（0.3mol/L）：量取鹽酸27mL，再加水稀釋至1L。
鹽酸溶液（8mol/L）：量取鹽酸680mL，再加水稀釋至1L。
氫氧化鈉溶液（10mol/L）：稱取氫氧化鈉400g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1L。
氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取氫氧化鈉40g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1L。
氫氧化鈉溶液（0.3mol/L）：稱取氫氧化鈉12g，先用少量水溶解后，再加水稀釋至1L。
PMP甲醇溶液（0.5mol/L）：稱取8.71g PMP，用甲醇溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中用甲醇定容。
磷酸二氫鉀溶液（0.1mol/L）：采用超純水配制，調(diào)節(jié)pH至6.7，過(guò)0.45μm水系微孔濾膜后備用（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
碳酸鈉溶液（0.5mol/L）：稱取碳酸鈉53g，置于500mL燒杯中，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中用水定容。
乙酰丙酮溶液：移取乙酰丙酮2.0mL，用碳酸鈉溶液（0.5mol/L）定容至50mL，于冰箱中放置過(guò)夜。
對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液：稱取對(duì)二甲氨基苯甲醛0.8g，溶于無(wú)醛乙醇15mL及濃鹽酸15mL中，混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00g/L）：稱取氨基葡萄糖鹽酸鹽0.100g，置于100mL燒杯中，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中用水定容。
氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）：移取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.00g/L）2.00mL至100mL容量瓶中，用水定容（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
1.3儀器
紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，配1cm比色皿；電子分析天平。
1.4供試樣品
樣品來(lái)源于肥料生產(chǎn)企業(yè)的肥料產(chǎn)品。
1.5樣品前處理
1.5.1 試樣的制備
將固體樣品采用四分法縮分至約100g，將其迅速研磨至全部通過(guò)0.50mm孔徑試驗(yàn)篩（如樣品潮濕，可通過(guò)1.00mm孔徑試驗(yàn)篩），混合均勻，置于潔凈、干燥的容器中；液體樣品經(jīng)搖動(dòng)均勻后，迅速取出約100mL，置于潔凈、干燥的容器中。
1.5.2 試樣溶液的制備
稱取混合均勻的0.5～1g固體試樣或5～10g液體試樣（精確至0.0001g，以含殼聚糖200～400mg為佳），置于100mL容量瓶中，先加入1.0mL濃鹽酸，然后加入水溶解后定容。移取1.00mL溶液至水解管中，加入1.0mL濃鹽酸和8.0mL鹽酸溶液（1+1），封管后于100℃水解24h。水解完成后，轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入氫氧化鈉溶液（10mol/L） 6mL后用鹽酸溶液（0.3mol/L）和氫氧化鈉溶液 （0.3mol/L）調(diào)節(jié)pH至7.0，然后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水定容。
1.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分光光度法
分別移取氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL置于7個(gè)具塞試管中，用水補(bǔ)充至5.00mL，該標(biāo)準(zhǔn)系列溶液含氨基葡萄糖鹽酸鹽的量分別為0、10.0、 20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg。分別加入乙酰丙酮溶液1.00mL，混勻，置于沸水浴中（1min后蓋塞）放置25min，取出，用冰水迅速冷卻至室溫，加入無(wú)醛乙醇3.00mL，再加入對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液1.00mL，混勻，于60℃水浴中（5min后蓋塞） 放置1h，取出立即用冷水冷卻至室溫，在波長(zhǎng)525nm處，用1cm比色皿進(jìn)行比色，以含氨基葡萄糖鹽酸鹽0 μg的標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)零，讀取吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液含氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.8試樣溶液的測(cè)定
分光光度法
準(zhǔn)確移取試樣溶液1.00～5.00mL（含氨基葡萄糖鹽酸鹽10～100 μg）置于具塞試管中，用水補(bǔ)充至5.00mL，在與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液相同的條件下顯色、比色，以空白實(shí)驗(yàn)溶液調(diào)零，讀取吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量（μg）。在測(cè)定過(guò)程中，若試樣溶液在加入顯色劑之前有顏色，則應(yīng)于另一具塞試管中，加入相同體積的試樣溶液，除顯色階段用1.00mL鹽酸溶液 （1+1）代替對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液外，其余操作相同，測(cè)定吸光度，計(jì)算時(shí)扣除該吸光度。
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美析儀器
可見(jiàn)分光光度計(jì)
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