非侵入式活體多光子顯微技術(shù)應(yīng)用于同步測(cè)量多種血管動(dòng)態(tài)變化
血管系統(tǒng)在響應(yīng)特定刺激時(shí)會(huì)發(fā)生直徑、通透性和血流的變化，但這些反應(yīng)在不同血管類型中的動(dòng)態(tài)和相互依賴性尚不清楚。本文介紹了一種基于多光子顯微鏡的非侵入性技術(shù)，結(jié)合圖像分析工具RVDM（相對(duì)速度、方向和形態(tài)），通過紅細(xì)胞參數(shù)識(shí)別血管類別，并利用Claudin5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的綠色熒光蛋白表達(dá)區(qū)分毛細(xì)血管亞型。研究顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）的皮內(nèi)注射可誘導(dǎo)循環(huán)右旋糖酐的泄漏，其動(dòng)力學(xué)具有血管類型依賴性，且泄漏主要發(fā)生在不表達(dá)GFP的毛細(xì)血管和小靜脈中。VEGFA誘導(dǎo)的毛細(xì)血管泄漏與血管擴(kuò)張和血流速度降低同步發(fā)生。這種非侵入性刺激結(jié)合RVDM分析的技術(shù)，能夠記錄和量化血管系統(tǒng)中的快速事件。
為同時(shí)測(cè)量大視野下多種血管的動(dòng)態(tài)變化，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了RVDM分析工具。傳統(tǒng)血流測(cè)量方法如XT（X維度隨時(shí)間掃描）或fXYT（快速X-Y時(shí)間成像）無法在慢幀率（1-5秒/幀）的sXYT（慢速X-Y時(shí)間）成像中準(zhǔn)確測(cè)量流速。此前，Kamoun等人提出的相對(duì)速度場(chǎng)掃描（RVFS）方法需多角度掃描，干擾了高速采集，不適用于VEGFA等刺激后的血管動(dòng)力學(xué)研究。RVDM工具基于sXYT成像中紅細(xì)胞的圖像變形原理：紅細(xì)胞圖像在激光掃描速度、血流速度和方向的共同作用下發(fā)生拉伸或收縮，通過測(cè)量變形尺寸（Xs和Ys）及紅細(xì)胞在掃描場(chǎng)內(nèi)的停留時(shí)間（T），可計(jì)算單個(gè)紅細(xì)胞的流速。
應(yīng)用多光子顯微鏡和RVDM分析，研究探討了VEGFA對(duì)血管通透性、直徑和血流的影響。皮內(nèi)注射VEGFA164后，循環(huán)中的熒光右旋糖酐（如2000 kDa FITC-右旋糖酐和70 kDa TRITC-菲科爾）從毛細(xì)血管和小靜脈的特定點(diǎn)泄漏。泄漏點(diǎn)沿血管長(zhǎng)度間隔分布，且僅出現(xiàn)在不表達(dá)Cldn5的毛細(xì)血管段和小靜脈中，而GFP陽(yáng)性的小動(dòng)脈和毛細(xì)血管段無泄漏現(xiàn)象。
RVDM分析基于天然未標(biāo)記紅細(xì)胞，無需熒光標(biāo)記，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程。其算法通過橢圓切線公式計(jì)算流速，誤差控制嚴(yán)格，適用于不同流向的血管。該技術(shù)還可擴(kuò)展到其他細(xì)胞運(yùn)動(dòng)研究，如白細(xì)胞動(dòng)力學(xué)或腫瘤血管響應(yīng)。結(jié)合Cldn5-GFP模型，實(shí)現(xiàn)了血管亞型的分子級(jí)識(shí)別，揭示了VEGFA響應(yīng)僅限于Cldn5缺陷血管的規(guī)律。這種高時(shí)空分辨率成像技術(shù)，不僅深化了對(duì)血管生理的理解，還為疾病機(jī)制（如癌癥血管泄漏）和藥物測(cè)試提供了新工具。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Honkura N, Richards M, Laviña B, Sáinz-Jaspeado M, Betsholtz C, Claesson-Welsh L. Intravital imaging-based analysis tools for vessel identification and assessment of concurrent dynamic vascular events. Nat Commun. 2018 Jul 16;9(1):2746.
本研究的核心貢獻(xiàn)來自Naoki Honkura、Mark Richards、Barbara Lavina、Miguel Sainz-Jaspeado、Christer Betsholtz和Lena Claesson-Welsh等研究者。他們共同發(fā)表的論文題為“Intravital imaging-based analysis tools for vessel identification and assessment of concurrent dynamic vascular events”，發(fā)表在《Nature Communications》期刊。該研究通過高分辨率活體成像技術(shù)，揭示了血管在刺激下的動(dòng)態(tài)響應(yīng)特性，為血管生物學(xué)提供了重要見解。
重要發(fā)現(xiàn)
01血管類型識(shí)別與分類
血管系統(tǒng)包括小動(dòng)脈、毛細(xì)血管和小靜脈等不同類型，它們對(duì)刺激的響應(yīng)存在顯著差異。傳統(tǒng)上，血管類型可通過直徑區(qū)分：小動(dòng)脈和小靜脈直徑通常≥10微米，毛細(xì)血管≤10微米。在耳部皮膚微血管系統(tǒng)中，血管類型的分布約為9%的小動(dòng)脈、75%的毛細(xì)血管和16%的小靜脈。然而，皮膚血管的隨機(jī)排列使得相似管徑的小動(dòng)脈和小靜脈難以區(qū)分。為解決這一問題，研究采用了熒光右旋糖酐的分布動(dòng)力學(xué)分析。通過尾靜脈注射2000 kDa FITC-右旋糖酐后，利用單光子時(shí)間推移成像觀察其分布：小動(dòng)脈在10秒內(nèi)首先顯影，隨后是毛細(xì)血管，最后是小靜脈和靜脈。這種分布模式可通過熱圖可視化，清晰區(qū)分不同血管類型。
血流速度是另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。通過紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度測(cè)量，小動(dòng)脈的血流速度超過100微米/秒，而小靜脈和毛細(xì)血管均低于100微米/秒。結(jié)合直徑和流速，可準(zhǔn)確識(shí)別血管類型。此外，緊密連接蛋白Claudin5（Cldn5）的表達(dá)模式進(jìn)一步細(xì)化了血管分類。免疫染色顯示，Cldn5在小動(dòng)脈和部分毛細(xì)血管中表達(dá)，而小靜脈表達(dá)缺失。利用Cldn5啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型（Cldn5(BAC)-GFP），可直接在活體成像中觀察Cldn5表達(dá)：GFP陽(yáng)性區(qū)域包括小動(dòng)脈和部分毛細(xì)血管（稱為陽(yáng)性毛細(xì)血管），而混合表達(dá)或無表達(dá)的毛細(xì)血管段以及小靜脈則顯示低或無GFP。這種表達(dá)模式與內(nèi)源性Cldn5分布一致，為血管功能研究提供了分子基礎(chǔ)。
02RVDM分析工具的開發(fā)與驗(yàn)證為同時(shí)測(cè)量大視野下多種血管的動(dòng)態(tài)變化，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了RVDM分析工具。傳統(tǒng)血流測(cè)量方法如XT（X維度隨時(shí)間掃描）或fXYT（快速X-Y時(shí)間成像）無法在慢幀率（1-5秒/幀）的sXYT（慢速X-Y時(shí)間）成像中準(zhǔn)確測(cè)量流速。此前，Kamoun等人提出的相對(duì)速度場(chǎng)掃描（RVFS）方法需多角度掃描，干擾了高速采集，不適用于VEGFA等刺激后的血管動(dòng)力學(xué)研究。RVDM工具基于sXYT成像中紅細(xì)胞的圖像變形原理：紅細(xì)胞圖像在激光掃描速度、血流速度和方向的共同作用下發(fā)生拉伸或收縮，通過測(cè)量變形尺寸（Xs和Ys）及紅細(xì)胞在掃描場(chǎng)內(nèi)的停留時(shí)間（T），可計(jì)算單個(gè)紅細(xì)胞的流速。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，RVDM與XT和fXYT成像的流速估計(jì)結(jié)果高度一致，尤其在流速超過20微米/秒時(shí)。RVDM的誤差范圍在5-15%之間，與傳統(tǒng)方法相當(dāng)。該工具還可生成整個(gè)血管網(wǎng)絡(luò)的速度圖，清晰顯示血管分叉和交匯處的流速變化。RVDM的優(yōu)勢(shì)在于僅需單幀圖像即可計(jì)算所有血管的流速，且兼容sXYT成像，允許在記錄其他血管事件（如泄漏或擴(kuò)張）的同時(shí)進(jìn)行血流測(cè)量。工具通過軟件實(shí)現(xiàn)，用戶可輸入掃描參數(shù)和紅細(xì)胞尺寸，自動(dòng)計(jì)算流速，避免了人為偏差。
03VEGFA誘導(dǎo)的血管動(dòng)態(tài)事件應(yīng)用多光子顯微鏡和RVDM分析，研究探討了VEGFA對(duì)血管通透性、直徑和血流的影響。皮內(nèi)注射VEGFA164后，循環(huán)中的熒光右旋糖酐（如2000 kDa FITC-右旋糖酐和70 kDa TRITC-菲科爾）從毛細(xì)血管和小靜脈的特定點(diǎn)泄漏。泄漏點(diǎn)沿血管長(zhǎng)度間隔分布，且僅出現(xiàn)在不表達(dá)Cldn5的毛細(xì)血管段和小靜脈中，而GFP陽(yáng)性的小動(dòng)脈和毛細(xì)血管段無泄漏現(xiàn)象。
泄漏動(dòng)力學(xué)分析顯示，VEGFA注射后約2分鐘內(nèi)開始泄漏（滯后期），隨后熒光強(qiáng)度在血管外增加，6-12分鐘后逐漸停止（泄漏持續(xù)時(shí)間）。小分子（如70 kDa菲科爾）的泄漏持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)（約12分鐘），而大分子（如2000 kDa右旋糖酐）在小靜脈中僅泄漏6分鐘。血管擴(kuò)張與泄漏同步發(fā)生：小靜脈直徑增加不到1.7倍，而毛細(xì)血管擴(kuò)張顯著，5分鐘內(nèi)增加三倍，且30分鐘后仍未完全恢復(fù)。血流方面，VEGFA導(dǎo)致小靜脈和毛細(xì)血管的血流速度顯著降低，尤以毛細(xì)血管為甚。這些變化表明，VEGFA通過影響血管張力和血流，調(diào)控微環(huán)境動(dòng)態(tài)。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破的技術(shù)難題
傳統(tǒng)血管成像技術(shù)如RVFS需多角度掃描，無法兼容并發(fā)動(dòng)態(tài)事件的記錄。RVDM工具通過單幀圖像分析紅細(xì)胞變形，解決了這一難題，實(shí)現(xiàn)了大視野下所有血管流速的同步測(cè)量。此外，非侵入性皮內(nèi)刺激方法避免了復(fù)雜手術(shù)（如顱窗植入）可能引發(fā)的炎癥反應(yīng)，確保了血管響應(yīng)的真實(shí)性。這些創(chuàng)新克服了以往技術(shù)對(duì)高速采集的依賴，為研究快速血管事件提供了可靠平臺(tái)。
RVDM分析基于天然未標(biāo)記紅細(xì)胞，無需熒光標(biāo)記，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程。其算法通過橢圓切線公式計(jì)算流速，誤差控制嚴(yán)格，適用于不同流向的血管。該技術(shù)還可擴(kuò)展到其他細(xì)胞運(yùn)動(dòng)研究，如白細(xì)胞動(dòng)力學(xué)或腫瘤血管響應(yīng)。結(jié)合Cldn5-GFP模型，實(shí)現(xiàn)了血管亞型的分子級(jí)識(shí)別，揭示了VEGFA響應(yīng)僅限于Cldn5缺陷血管的規(guī)律。這種高時(shí)空分辨率成像技術(shù)，不僅深化了對(duì)血管生理的理解，還為疾病機(jī)制（如癌癥血管泄漏）和藥物測(cè)試提供了新工具。
總結(jié)與展望
本研究通過非侵入性多光子顯微鏡和RVDM分析工具，系統(tǒng)揭示了血管在VEGFA刺激下的動(dòng)態(tài)響應(yīng)。技術(shù)層面，RVDM實(shí)現(xiàn)了流速、泄漏和擴(kuò)張的同步量化，突破了傳統(tǒng)方法的局限；生物學(xué)層面，發(fā)現(xiàn)了Cldn5表達(dá)與血管功能的相關(guān)性，為靶向治療提供了新靶點(diǎn)。未來，該技術(shù)可應(yīng)用于炎癥、腫瘤等病理模型，探索血管在疾病中的特異性變化。同時(shí)，通過優(yōu)化成像參數(shù)，RVDM可適應(yīng)不同血管床的流速范圍，進(jìn)一步拓展其應(yīng)用場(chǎng)景�？傊�，這項(xiàng)研究不僅推動(dòng)了血管生物學(xué)的技術(shù)進(jìn)步，也為臨床轉(zhuǎn)化奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Honkura N, Richards M, Laviña B, Sáinz-Jaspeado M, Betsholtz C, Claesson-Welsh L. Intravital imaging-based analysis tools for vessel identification and assessment of concurrent dynamic vascular events. Nat Commun. 2018 Jul 16;9(1):2746.
DOI:10.1038/s41467-018-04929-8.
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