共聚焦顯微鏡鈣成像技術(shù)：基于光誘導的細胞信號調(diào)控工具
光遺傳學技術(shù)在生物醫(yī)學研究領(lǐng)域已成為革命性的調(diào)控工具，通過光敏蛋白實現(xiàn)對細胞功能的高精度時空調(diào)控。然而，現(xiàn)有光控二聚化系統(tǒng)存在標簽尺寸大、背景活性高、組織穿透性有限等挑戰(zhàn)。本文解析的PhoBIT（Photo-inducible Binary Interaction Tools）系統(tǒng)通過創(chuàng)新性地工程化細菌來源的ssrA-sspB降解系統(tǒng)，成功開發(fā)出尺寸最小、背景噪聲最低的光控工具。該技術(shù)利用僅7個氨基酸的ssrA標簽與光敏蛋白融合的sspB組合，實現(xiàn)了對GPCR信號傳導、離子通道激活、細胞死亡調(diào)控和免疫應(yīng)答的光控操縱，為精準醫(yī)療提供了全新的技術(shù)平臺。
02先進成像技術(shù)的應(yīng)用
研究團隊采用多種光學成像技術(shù)驗證PhoBIT系統(tǒng)功能。共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測了蛋白質(zhì)定位和細胞響應(yīng)，特別是線粒體錨定實驗清晰展示了光控結(jié)合/解離過程。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET） assay定量評估了分子間相互作用強度，通過測量NanoLuc與Venus間的能量轉(zhuǎn)移效率，精確量化了不同突變體的結(jié)合特性。
通過一系列精心設(shè)計的實驗，研究人員證明了PhoBIT系統(tǒng)的高精度光控能力。在GPCR調(diào)控實驗中，利用Tango assay系統(tǒng)監(jiān)測PAR受體激活，發(fā)現(xiàn)光刺激可誘導2.2-5.7倍的報告基因表達增加。在CRISPRi應(yīng)用中，PhoBIT1實現(xiàn)了60%的光控基因表達抑制釋放。最令人印象深刻的是在壞死性死亡調(diào)控中，僅MLKL-NT-ssrA2-mCherry構(gòu)建體（A2構(gòu)型）能誘導光依賴性細胞死亡，6分鐘后出現(xiàn)膜破裂，展示了時間精確的細胞命運控制。
本研究由Yi-Tsang Lee、Lei Guo、Tien-Hung Lan、Tatsuki Nonomura、Gan Liu、Guolin Ma、Rui Wang、Yun Huang和Yubin Zhou共同完成，論文題為"Engineering of photo-inducible binary interaction tools for biomedical applications"，于2025年7月在《Nature Communications》期刊上發(fā)表在線出版。
技術(shù)原理
01主流光控方法及其局限
當前主流光控系統(tǒng)主要基于光敏二聚化模塊，包括藍光響應(yīng)的CRY2-CIB1、LOV2-Zdk1系統(tǒng)，紫外響應(yīng)的UVR8-COP1系統(tǒng)，以及紅光響應(yīng)的PhyB-PIF系統(tǒng)。這些系統(tǒng)雖然廣泛應(yīng)用，但存在明顯局限性：光敏蛋白尺寸較大（通常超過400個氨基酸），容易干擾目標蛋白功能；二聚化動力學較慢；不同系統(tǒng)間存在光譜串擾問題。特別是CRY2和LOV2系統(tǒng)在黑暗狀態(tài)下常有基礎(chǔ)二聚化活性，導致背景信號較高。
02PhoBIT系統(tǒng)的獨特機制
PhoBIT系統(tǒng)創(chuàng)新性地利用大腸桿菌蛋白質(zhì)降解機制中的ssrA-sspB配對系統(tǒng)。ssrA是一個僅含7個氨基酸的短肽標簽，而sspB是其13kDa的結(jié)合蛋白。研究人員通過兩種策略改造這一系統(tǒng)：PhoBIT1作為"光關(guān)"開關(guān)，將LOV2結(jié)構(gòu)域插入sspB中，使光誘導的構(gòu)象變化變構(gòu)調(diào)節(jié)ssrA結(jié)合口袋，導致光刺激下的解離；PhoBIT2作為"光開"開關(guān)，將CRY2與優(yōu)化的sspB突變體（A56F）融合，利用CRY2的光誘導寡聚化增強與突變ssrA（A2C）的結(jié)合。
該系統(tǒng)核心優(yōu)勢在于ssrA標簽的極小尺寸（僅7個氨基酸），可插入大多數(shù)蛋白質(zhì)而不影響其功能，同時保持低背景活性和高光誘導動態(tài)范圍。通過深度突變掃描和結(jié)合親和力優(yōu)化，研究人員獲得了背景相互作用最低、光誘導響應(yīng)最強的突變組合。
重要發(fā)現(xiàn)
01光學調(diào)控機制的創(chuàng)新
PhoBIT系統(tǒng)的核心光學創(chuàng)新在于其獨特的光控機制。PhoBIT1通過將LOV2結(jié)構(gòu)域插入sspB的環(huán)區(qū)（特別是S5位點），實現(xiàn)了光依賴的變構(gòu)調(diào)節(jié)。在黑暗狀態(tài)下，LOV2保持sspB與ssrA的結(jié)合能力；藍光照射后，LOV2的Jα螺旋構(gòu)象變化導致ssrA結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)改變，引發(fā)解離。動力學分析顯示其解離半衰期為8.5秒，再結(jié)合半衰期為28.1秒，表現(xiàn)出高度可逆性。
PhoBIT2則采用完全不同的光學機制：通過CRY2的光誘導寡聚化增強結(jié)合。研究人員對ssrA肽庫進行深度突變掃描，篩選出140種變異體，最終確定A2C突變體與sspB-A56F組合具有最低背景和最高光誘導結(jié)合能力（9.9倍增加）。這種"光開"機制利用CRY2在藍光下的快速寡聚化特性，將sspB突變體聚集到ssrA標簽位置，顯著增強結(jié)合親和力。
02先進成像技術(shù)的應(yīng)用
研究團隊采用多種光學成像技術(shù)驗證PhoBIT系統(tǒng)功能。共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測了蛋白質(zhì)定位和細胞響應(yīng)，特別是線粒體錨定實驗清晰展示了光控結(jié)合/解離過程。生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET） assay定量評估了分子間相互作用強度，通過測量NanoLuc與Venus間的能量轉(zhuǎn)移效率，精確量化了不同突變體的結(jié)合特性。
鈣成像技術(shù)揭示了PhoBIT2調(diào)控STIM1-ORAI通道的動力學過程。使用超靈敏基因編碼鈣指示劑NEMO，研究人員監(jiān)測到光誘導鈣內(nèi)流的快速啟動（半衰期0.4分鐘）和關(guān)閉（半衰期2.9分鐘）。此外，熒光漂白后恢復（FRAP）和單粒子追蹤技術(shù)分析了蛋白質(zhì)運動性和聚集狀態(tài)，為機制理解提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。
03光控精準性的實驗驗證通過一系列精心設(shè)計的實驗，研究人員證明了PhoBIT系統(tǒng)的高精度光控能力。在GPCR調(diào)控實驗中，利用Tango assay系統(tǒng)監(jiān)測PAR受體激活，發(fā)現(xiàn)光刺激可誘導2.2-5.7倍的報告基因表達增加。在CRISPRi應(yīng)用中，PhoBIT1實現(xiàn)了60%的光控基因表達抑制釋放。最令人印象深刻的是在壞死性死亡調(diào)控中，僅MLKL-NT-ssrA2-mCherry構(gòu)建體（A2構(gòu)型）能誘導光依賴性細胞死亡，6分鐘后出現(xiàn)膜破裂，展示了時間精確的細胞命運控制。
挑戰(zhàn)與展望
PhoBIT技術(shù)雖然展現(xiàn)出巨大潛力，但其臨床轉(zhuǎn)化仍面臨多重挑戰(zhàn)。首先，藍光組織穿透性有限，盡管本研究證明了在皮下移植瘤模型中的有效性，但對于深層組織應(yīng)用仍需開發(fā)紅光或近紅外響應(yīng)版本。其次，病毒遞送系統(tǒng)的安全性和效率需要進一步優(yōu)化，特別是體內(nèi)靶向遞送效率。第三，長期表達可能引發(fā)的免疫反應(yīng)和毒性需要系統(tǒng)評估。此外，光控系統(tǒng)的時空精度雖然在細胞水平令人滿意，但在整體動物水平需要更精確的光傳遞系統(tǒng)。未來研究方向應(yīng)包括開發(fā)多色正交系統(tǒng)實現(xiàn)多重調(diào)控，優(yōu)化光敏蛋白的動力學參數(shù)以適應(yīng)不同應(yīng)用場景，以及探索非病毒遞送策略提高治療安全性。同時，將PhoBIT技術(shù)與現(xiàn)有治療手段（如化療、免疫治療）結(jié)合，開發(fā)聯(lián)合治療方案也是重要方向。最終，通過進一步理解光控機制的分子細節(jié)和優(yōu)化系統(tǒng)性能，PhoBIT技術(shù)有望成為精準醫(yī)療領(lǐng)域的顛覆性工具，為癌癥、神經(jīng)疾病和免疫 disorders提供全新的治療范式。
論文信息
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。
Lee YT, Guo L, Lan TH, Nonomura T, Liu G, Ma G, Wang R, Huang Y, Zhou Y. Engineering of photo-inducible binary interaction tools for biomedical applications. Nat Commun. 2025 Jul 28;16(1):6940.
DOI:10.1038/s41467-025-61710-4.
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