自由移動動物雙光子成像：新型顯微鏡實時三維運(yùn)動校正功能
在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，直接測量自由移動動物的大腦活動是理解行為控制機(jī)制的關(guān)鍵。然而，大腦運(yùn)動帶來的翻譯、旋轉(zhuǎn)和變形會干擾熒光信號的定量測量，尤其是使用雙光子顯微鏡時，運(yùn)動敏感性更高，傳統(tǒng)方法需要將顯微鏡固定于大腦。近期，一項突破性研究通過開發(fā)新型顯微鏡技術(shù)，實現(xiàn)了在自由移動動物中進(jìn)行實時三維運(yùn)動校正的功能成像。
實驗在自由爬行的果蠅幼蟲中進(jìn)行，幼蟲在瓊脂糖包被的蓋玻片上爬行，顯微鏡通過實時跟蹤參考神經(jīng)元來穩(wěn)定成像體積。研究重點(diǎn)關(guān)注了幼蟲腹神經(jīng)索（VNC）中的節(jié)段重復(fù)中間神經(jīng)元，如A27h premotor神經(jīng)元和Even-skipped+ lateral（EL）本體感覺神經(jīng)元。通過雙色標(biāo)記（GCaMP6f/mCherry），CRASH2p記錄了在前進(jìn)和后退爬行期間的神經(jīng)活動。成像數(shù)據(jù)經(jīng)過多階段配準(zhǔn)管道處理：先校正剛性運(yùn)動（旋轉(zhuǎn)和平移），再通過B樣條基自由形變校正非剛性變形，最后應(yīng)用強(qiáng)度校正以消除空間不均一熒光變化。結(jié)果顯示，在前進(jìn)爬行時，A27h神經(jīng)元的中央過程呈現(xiàn)后前傳播的活動波，而在后退爬行時活動被抑制；相反，M神經(jīng)元（與A27h形態(tài)相近）在后退爬行時表現(xiàn)活躍。這些發(fā)現(xiàn)通過主成分分析（PCA）進(jìn)一步驗證，顯示活動波具有解剖特異性，且綠色熒光變化與行為同步，而紅色通道無類似模式，排除了運(yùn)動偽影。
03光學(xué)成像技術(shù)的優(yōu)勢與驗證
CRASH2p的光學(xué)設(shè)計顯著提升了成像性能。雙光子激發(fā)減少了散射和脫靶熒光的影響，而閉環(huán)跟蹤補(bǔ)償了平移運(yùn)動。Pong掃描策略通過高頻采樣（如400 kHz軸向線速率）實現(xiàn)了10 Hz體積成像速率，確保在毫米/秒級運(yùn)動下保持微米級分辨率。此外，時間多路復(fù)用技術(shù)將跟蹤和成像路徑的紅色光子分離，避免了串?dāng)_。實驗還通過對照組（如GFP標(biāo)記的幼蟲）驗證了信號特異性：在GCaMP標(biāo)記的動物中，旅行波表示解釋了大部分方差，而GFP對照組無此現(xiàn)象，證實了鈣指示劑的動態(tài)響應(yīng)。這些技術(shù)使得在自由行為中首次觀察到EL神經(jīng)元在前進(jìn)爬行時的活動波，以及Mooncrawler Descending Neuron（MDN）在后退爬行時的活動增強(qiáng)，突出了細(xì)胞分辨率成像的重要性。
技術(shù)亮點(diǎn)包括雙掃描頭設(shè)計、諧振TAG透鏡軸向掃描和時間多路復(fù)用檢測。Pong掃描作為關(guān)鍵創(chuàng)新，通過三角波驅(qū)動替代正弦Lissajous掃描，提高了采樣均勻性，減少了運(yùn)動失真。多階段配準(zhǔn)管道結(jié)合了剛性校正、B樣條形變和強(qiáng)度平滑，確保熒光比率計量的準(zhǔn)確性。這些技術(shù)使得成像速度達(dá)10 Hz體積速率，在200毫秒內(nèi)完成200×200×50微米體積采樣，同時保持細(xì)胞分辨率。此外，雙色成像策略通過紅色參考通道校正了光學(xué)路徑變化，提升了信號可靠性。
03科學(xué)價值與應(yīng)用前景
CRASH2p的價值體現(xiàn)在推動模型生物研究上。果蠅幼蟲作為系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)模型，具有遺傳工具豐富、神經(jīng)元可識別和全腦連接組圖譜完整等優(yōu)勢，但此前難以在自由行為中記錄活動。本研究不僅發(fā)現(xiàn)了A27h和M神經(jīng)元在相反行為模式中的分工，還證實了EL神經(jīng)元的本體感覺角色，為運(yùn)動控制和本體感覺研究提供了新見解。技術(shù)通用性高，可擴(kuò)展至其他小動物或厚組織成像，潛在應(yīng)用包括行為神經(jīng)科學(xué)、疾病模型和光學(xué)遺傳學(xué)操縱。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
McNulty P, Wu R, Yamaguchi A, Heckscher ES, Haas A, Nwankpa A, Skanata MM, Gershow AM. Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5950.
這項研究名為“Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal”，由Paul McNulty、Rui Wu、Akihiro Yamaguchi、Ellie S. Heckscher、Andrew Haas、Amajindi Nwankpa、Mirna Mihovilovic Skanata和Marc Gershow共同完成。該論文于2025年7月在《Nature Communications》期刊上在線發(fā)表。這項工作不僅解決了運(yùn)動偽影的難題，還首次在自由爬行的果蠅幼蟲中實現(xiàn)了細(xì)胞分辨率的功能成像，揭示了先前未知的神經(jīng)行為關(guān)聯(lián)。
重要發(fā)現(xiàn)
01CRASH2p顯微鏡的技術(shù)原理與實現(xiàn)
本研究核心貢獻(xiàn)是開發(fā)了閉環(huán)諧振軸向掃描高速雙光子（CRASH2p）顯微鏡，能夠在自由移動動物中實現(xiàn)實時三維運(yùn)動校正的體積功能成像。傳統(tǒng)雙光子顯微鏡對運(yùn)動高度敏感，且需物理連接限制動物行為，而CRASH2p通過雙掃描頭設(shè)計（跟蹤頭和成像頭）實現(xiàn)了無創(chuàng)成像。跟蹤頭使用1070納米脈沖激光專用于跟蹤單個參考神經(jīng)元（通過鈣不敏感紅色熒光蛋白mCherry標(biāo)記），通過圓柱形掃描和卡爾曼濾波實時估計神經(jīng)元位置，并以亞毫秒延遲和亞微米精度反饋至成像系統(tǒng)。成像頭則采用920納米激光激發(fā)綠色鈣指示劑（如GCaMP6f），并結(jié)合“Pong”掃描策略進(jìn)行體積成像。Pong掃描通過三角波驅(qū)動x和y軸掃描器，替代傳統(tǒng)光柵掃描，消除了慢軸問題，使采樣更均勻分布，有助于校正旋轉(zhuǎn)和變形。雙色成像允許通過紅色通道校正運(yùn)動引起的熒光變化，確保綠色信號準(zhǔn)確反映神經(jīng)活動。
實驗在自由爬行的果蠅幼蟲中進(jìn)行，幼蟲在瓊脂糖包被的蓋玻片上爬行，顯微鏡通過實時跟蹤參考神經(jīng)元來穩(wěn)定成像體積。研究重點(diǎn)關(guān)注了幼蟲腹神經(jīng)索（VNC）中的節(jié)段重復(fù)中間神經(jīng)元，如A27h premotor神經(jīng)元和Even-skipped+ lateral（EL）本體感覺神經(jīng)元。通過雙色標(biāo)記（GCaMP6f/mCherry），CRASH2p記錄了在前進(jìn)和后退爬行期間的神經(jīng)活動。成像數(shù)據(jù)經(jīng)過多階段配準(zhǔn)管道處理：先校正剛性運(yùn)動（旋轉(zhuǎn)和平移），再通過B樣條基自由形變校正非剛性變形，最后應(yīng)用強(qiáng)度校正以消除空間不均一熒光變化。結(jié)果顯示，在前進(jìn)爬行時，A27h神經(jīng)元的中央過程呈現(xiàn)后前傳播的活動波，而在后退爬行時活動被抑制；相反，M神經(jīng)元（與A27h形態(tài)相近）在后退爬行時表現(xiàn)活躍。這些發(fā)現(xiàn)通過主成分分析（PCA）進(jìn)一步驗證，顯示活動波具有解剖特異性，且綠色熒光變化與行為同步，而紅色通道無類似模式，排除了運(yùn)動偽影。
03光學(xué)成像技術(shù)的優(yōu)勢與驗證
CRASH2p的光學(xué)設(shè)計顯著提升了成像性能。雙光子激發(fā)減少了散射和脫靶熒光的影響，而閉環(huán)跟蹤補(bǔ)償了平移運(yùn)動。Pong掃描策略通過高頻采樣（如400 kHz軸向線速率）實現(xiàn)了10 Hz體積成像速率，確保在毫米/秒級運(yùn)動下保持微米級分辨率。此外，時間多路復(fù)用技術(shù)將跟蹤和成像路徑的紅色光子分離，避免了串?dāng)_。實驗還通過對照組（如GFP標(biāo)記的幼蟲）驗證了信號特異性：在GCaMP標(biāo)記的動物中，旅行波表示解釋了大部分方差，而GFP對照組無此現(xiàn)象，證實了鈣指示劑的動態(tài)響應(yīng)。這些技術(shù)使得在自由行為中首次觀察到EL神經(jīng)元在前進(jìn)爬行時的活動波，以及Mooncrawler Descending Neuron（MDN）在后退爬行時的活動增強(qiáng)，突出了細(xì)胞分辨率成像的重要性。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破傳統(tǒng)成像難題
CRASH2p顯微鏡突破了自由移動動物中雙光子成像的長期難題。傳統(tǒng)方法受限于運(yùn)動偽影，尤其是昆蟲等小動物，其大腦在行為中會發(fā)生劇烈變形。本研究通過實時閉環(huán)跟蹤，無需植入標(biāo)記物即可補(bǔ)償三維平移，結(jié)合Pong掃描和非剛性配準(zhǔn)，校正了旋轉(zhuǎn)和變形，實現(xiàn)了在果蠅幼蟲中的穩(wěn)定體積成像。這解決了單光子成像中散射敏感和雙光子成像中運(yùn)動敏感的權(quán)衡問題，為研究自然行為下的神經(jīng)電路提供了新途徑。
技術(shù)亮點(diǎn)包括雙掃描頭設(shè)計、諧振TAG透鏡軸向掃描和時間多路復(fù)用檢測。Pong掃描作為關(guān)鍵創(chuàng)新，通過三角波驅(qū)動替代正弦Lissajous掃描，提高了采樣均勻性，減少了運(yùn)動失真。多階段配準(zhǔn)管道結(jié)合了剛性校正、B樣條形變和強(qiáng)度平滑，確保熒光比率計量的準(zhǔn)確性。這些技術(shù)使得成像速度達(dá)10 Hz體積速率，在200毫秒內(nèi)完成200×200×50微米體積采樣，同時保持細(xì)胞分辨率。此外，雙色成像策略通過紅色參考通道校正了光學(xué)路徑變化，提升了信號可靠性。
03科學(xué)價值與應(yīng)用前景
CRASH2p的價值體現(xiàn)在推動模型生物研究上。果蠅幼蟲作為系統(tǒng)神經(jīng)科學(xué)模型，具有遺傳工具豐富、神經(jīng)元可識別和全腦連接組圖譜完整等優(yōu)勢，但此前難以在自由行為中記錄活動。本研究不僅發(fā)現(xiàn)了A27h和M神經(jīng)元在相反行為模式中的分工，還證實了EL神經(jīng)元的本體感覺角色，為運(yùn)動控制和本體感覺研究提供了新見解。技術(shù)通用性高，可擴(kuò)展至其他小動物或厚組織成像，潛在應(yīng)用包括行為神經(jīng)科學(xué)、疾病模型和光學(xué)遺傳學(xué)操縱。
總結(jié)與展望
CRASH2p顯微鏡的成功開發(fā)標(biāo)志著自由移動動物中雙光子功能成像的重大進(jìn)步，通過實時運(yùn)動校正和體積成像，實現(xiàn)了細(xì)胞分辨率的神經(jīng)活動記錄。這項技術(shù)不僅克服了傳統(tǒng)成像的運(yùn)動限制，還揭示了果蠅幼蟲VNC中節(jié)段神經(jīng)元的動態(tài)活動波，為理解行為控制的神經(jīng)基礎(chǔ)提供了新證據(jù)。未來，該技術(shù)可進(jìn)一步優(yōu)化，如集成旋轉(zhuǎn)跟蹤以提升校正能力，或結(jié)合高速成像技術(shù)（如FACED或LBM）實現(xiàn)更高幀率。此外，擴(kuò)展至密集標(biāo)記組織或其他模型生物將拓寬其在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用。總之，CRASH2p為研究自然行為下的全腦活動開辟了新道路，有望推動精準(zhǔn)神經(jīng)環(huán)路解析和行為學(xué)研究的發(fā)展。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
McNulty P, Wu R, Yamaguchi A, Heckscher ES, Haas A, Nwankpa A, Skanata MM, Gershow AM. Closed-loop two-photon functional imaging in a freely moving animal. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5950.
DOI:10.1038/s41467-025-60648-x.
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