實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）是生命科學(xué)領(lǐng)域的革命性技術(shù)，能在 PCR 擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的精確定量。熒光定量 PCR 已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，但其特異性優(yōu)化仍是許多研究者面臨的挑戰(zhàn)。

然而，PCR 特異性問(wèn)題始終困擾著許多研究人員。非特異性擴(kuò)增不僅會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，還會(huì)浪費(fèi)寶貴的樣本和時(shí)間。本文將詳細(xì)介紹提高 PCR 特異性的九大方法，并結(jié)合最新市場(chǎng)數(shù)據(jù)，幫助您選擇適合的熒光定量 PCR 儀器和試劑。

一、引物設(shè)計(jì)：特異性擴(kuò)增的基石

細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是 PCR 中最重要的一步。理想的引物對(duì)只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)同擴(kuò)增其他的非目的序列。

引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵原則

• 長(zhǎng)度適宜：典型的引物 18 到 24 個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，但大于 24 核苷的引物并不意味著更高的特異性。

• GC 含量合理：選擇 GC 含量為 40％到 60％或 GC 含量映像模板 GC 含量的引物。設(shè)計(jì) 5' 端和中間區(qū)為 G 或 C 的引物，增加引物穩(wěn)定性。

• 避免二聚體：避免引物對(duì) 3' 末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。

• 3' 末端設(shè)計(jì)：避免 3' 末端富含 GC，保證在最后 5 個(gè)核苷中含有 3 個(gè) A 或 T。避免 3' 末端的錯(cuò)誤配對(duì)。

• 二級(jí)結(jié)構(gòu)：避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。

使用 NCBI Primer-BLAST 工具進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意跨外顯子連接區(qū)設(shè)計(jì)，避免基因組 DNA 擴(kuò)增。

二、引物退火溫度：精確控制的關(guān)鍵

熔解溫度（Tm）是當(dāng) 50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈 DNA 分子時(shí)的溫度。Tm 對(duì)于設(shè)定 PCR 退火溫度是必需的。

優(yōu)化策略

• 合理的退火溫度從 55℃到 70℃，一般設(shè)定比引物的 Tm 低 5℃。

• 為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的 Tm 值（差異不超過(guò) 5℃）。

• 可以通過(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性，以 2℃為增量逐步提高退火溫度。

遞減 PCR 通過(guò)在 PCR 的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火條件提高特異性。循環(huán)開始在比估算的 Tm 高大約 5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低 1℃到 2℃，直到退火溫度低于 Tm 5℃。

這種方法只有同源性最高的目的模板會(huì)被擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增，并會(huì)將擴(kuò)增的非特異性產(chǎn)物排擠出去。

引物的濃度會(huì)影響特異性。最佳的引物濃度一般在 0.1 到 0.5μM。較高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。

可以使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過(guò) Beers 法則計(jì)算引物濃度。避免使用寡聚核苷酸作為標(biāo)準(zhǔn)在 EB 染色的膠上估算引物濃度，因?yàn)橐�物和�?biāo)準(zhǔn)的染色能力根據(jù)序列不同而差異很大。

定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù) PCR 應(yīng)用是足夠的。但部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過(guò)程中的任何非全長(zhǎng)序列。

引物保存建議

• 最好在 TE 重溶引物，使其最終濃度為 100μM。

• 將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在 - 20℃。

• 大于 10μM 濃度溶于 TE 的引物在 - 20℃可以穩(wěn)定保存 6 個(gè)月。

• 干粉引物可以在 - 20℃保存至少 1 年。

熱啟動(dòng) PCR 是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高 PCR 特異性最重要的方法之一。盡管 Taq DNA 聚合酶的最佳延伸溫度在 72℃，聚合酶在室溫仍然有活性，因此在進(jìn)行 PCR 反應(yīng)配制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。

Platinum Taq DNA 聚合酶對(duì)于自動(dòng)熱啟動(dòng) PCR 來(lái)說(shuō)方便高效。同經(jīng)化學(xué)修飾用于熱啟動(dòng)的 Taq DNA 聚合酶相比，Platinum 酶不需要在 94℃延時(shí)保溫（10 到 15 分鐘）以激活聚合酶。

鎂離子影響 PCR 的多個(gè)方面，如 DNA 聚合酶的活性，這會(huì)影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會(huì)影響特異性。包含 200μM dNTP 的典型 PCR 起始濃度是 1.5mM（對(duì)實(shí)時(shí)定量 PCR，使用 3 到 5mM 帶有熒光探針的鎂離子溶液）。

為了確定最佳濃度，從 1mM 到 3mM，以 0.5mM 遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。Platinum Taq DNA 聚合酶能夠在比 Taq DNA 聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。

對(duì)于高 GC 含量的模板等困難模板，需要添加輔助物質(zhì)。PCR 添加劑包括甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜堿以及 PCRx Enhancer Solution 可以增強(qiáng)擴(kuò)增。

它們可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助 DNA 聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)。為獲得最佳結(jié)果，應(yīng)優(yōu)化添加劑的濃度，尤其是會(huì)抑制 Taq DNA 聚合酶的 DMSO、甲酰胺和甘油。

使用巢式引物進(jìn)行連續(xù)多輪擴(kuò)增可以顯著提高特異性和靈敏度。第一輪是 15 到 20 個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增，將一小部分起始擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋 100 到 1000 倍加入到第二輪擴(kuò)增中進(jìn)行 15 到 20 個(gè)循環(huán)。

在第二輪擴(kuò)增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物內(nèi)側(cè)的靶序列結(jié)合。巢式 PCR 的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥瑑商滓�物都互補(bǔ)的靶序列很少。

實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制要點(diǎn)

為確保 qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性，必須設(shè)置以下五種必要對(duì)照：

• NTC（無(wú)模板對(duì)照）：監(jiān)測(cè)引物二聚體 / 體系污染。

• NRT（無(wú)逆轉(zhuǎn)錄對(duì)照）：檢測(cè) gDNA 殘留。

• 陽(yáng)性對(duì)照：確認(rèn)反應(yīng)體系有效性。

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線：計(jì)算引物擴(kuò)增效率。

• 內(nèi)參對(duì)照：樣本間歸一化基準(zhǔn)。

提高 PCR 特異性需要綜合考慮引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件優(yōu)化和添加劑使用等多個(gè)方面。通過(guò)本文介紹的九種方法，您可以顯著提高 PCR 反應(yīng)的特異性，獲得更加可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

同時(shí)，選擇高質(zhì)量的 PCR 儀器和試劑也是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性的重要因素。根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求和預(yù)算，選擇適合的熒光定量 PCR 儀，將有助于您獲得更加準(zhǔn)確和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。