雙光子-光聲顯微鏡同步實(shí)現(xiàn)微血管140μm與神經(jīng)元>300μm深層成像
為解決現(xiàn)有功能性神經(jīng)成像技術(shù)在分辨率、穿透深度和時(shí)空對(duì)齊方面的權(quán)衡問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種結(jié)合光學(xué)分辨率光聲顯微鏡與雙光子熒光顯微鏡的雙模系統(tǒng)，可在小鼠皮層實(shí)現(xiàn)亞微米分辨率的微血管成像（最深 140μm）和神經(jīng)元成像（超過(guò) 300μm），通過(guò)半同步采集協(xié)議確保時(shí)空對(duì)齊，為神經(jīng)血管耦合研究提供有力工具。該研究由 Shruti Sundar、Tian Jin、Yu-Hang Liu 等學(xué)者共同完成，文章名為《Integrated two-photon and optoacoustic microscopy for functional neuroimaging》，于 2025 年 7 月發(fā)表在《Scientific Reports》期刊。
研究者們利用2P-LSM系統(tǒng)對(duì)活體小鼠大腦進(jìn)行了深入成像研究。
穿透深度與分辨率：實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠大腦皮層下超過(guò)600微米深度的清晰成像，分辨率達(dá)到亞細(xì)胞水平（橫向~1μm，軸向~5μm），清晰分辨了深層神經(jīng)元胞體、樹(shù)突棘以及精細(xì)的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這顯著超越了傳統(tǒng)單光子光片顯微鏡在活體組織中的穿透極限。
成像速度與范圍：系統(tǒng)能以高達(dá)10Hz的體積速率（即每秒完成10次完整的三維體積掃描）對(duì)數(shù)百微米尺度的組織體積進(jìn)行成像。例如，可以在數(shù)秒內(nèi)完成對(duì)整個(gè)小鼠丘腦區(qū)域（~600x600x600μm³）的高分辨率三維成像。
活體動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)：成功捕捉了活體小鼠大腦深層區(qū)域（如丘腦、下丘腦）的多種快速動(dòng)態(tài)生理過(guò)程。
神經(jīng)元活動(dòng)：利用基因編碼鈣指示劑（如GCaMP6），實(shí)時(shí)記錄了深層神經(jīng)元群體在數(shù)十赫茲頻率下的鈣瞬變活動(dòng)，揭示了神經(jīng)回路的活動(dòng)模式。
血流動(dòng)力學(xué)：通過(guò)注射熒光染料（如FITC-葡聚糖）標(biāo)記血漿，清晰成像并量化了深層毛細(xì)血管網(wǎng)中的紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡和速度，以及血管直徑的瞬時(shí)變化。
免疫細(xì)胞行為：觀(guān)察到小膠質(zhì)細(xì)胞在深層腦區(qū)的動(dòng)態(tài)形態(tài)變化和遷移行為。
低光損傷驗(yàn)證：長(zhǎng)時(shí)間成像實(shí)驗(yàn)表明，與點(diǎn)掃描2PE相比，2P-LSM在相同成像深度和分辨率下，顯著降低了光漂白和光毒性，使得對(duì)同一活體區(qū)域進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間（數(shù)小時(shí)）重復(fù)觀(guān)測(cè)成為可能，這對(duì)研究長(zhǎng)期生理過(guò)程至關(guān)重要。
將雙光子激發(fā)與光片照明相結(jié)合是本研究的核心技術(shù)創(chuàng)新。此前，這兩種技術(shù)主要獨(dú)立發(fā)展。研究者們解決了關(guān)鍵的技術(shù)挑戰(zhàn)，如高效生成適用于雙光子激發(fā)的薄而均勻的近紅外光片，設(shè)計(jì)緊湊的光路實(shí)現(xiàn)光片側(cè)向入射與熒光信號(hào)垂直收集的幾何構(gòu)型，以及優(yōu)化系統(tǒng)以匹配高速相機(jī)的探測(cè)能力。這種融合并非簡(jiǎn)單疊加，而是創(chuàng)造了一種性能遠(yuǎn)超各自獨(dú)立應(yīng)用的新型成像模態(tài)。
03顯著性能提升與獨(dú)特價(jià)值
無(wú)與倫比的成像深度與分辨率：在活體哺乳動(dòng)物腦組織中穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)600微米以上的高分辨率（亞細(xì)胞水平）成像，這是傳統(tǒng)光片顯微鏡難以企及的深度。
革命性的成像速度：體積成像速率達(dá)到Hz級(jí)別（例如10Hz），比傳統(tǒng)點(diǎn)掃描雙光子顯微鏡快數(shù)十倍甚至百倍，能夠清晰捕捉神經(jīng)元放電、血流等快速生理事件的三維動(dòng)態(tài)。
極低的光毒性：結(jié)合了雙光子激發(fā)的內(nèi)在層析性和光片照明的并行照明優(yōu)勢(shì)，顯著降低了單位體積和單位時(shí)間的光劑量，使得長(zhǎng)時(shí)間、重復(fù)的活體觀(guān)測(cè)成為現(xiàn)實(shí)，特別適合發(fā)育生物學(xué)和長(zhǎng)期行為研究。
大成像范圍：能夠一次性對(duì)數(shù)百微米尺度的組織體積進(jìn)行成像，提供更全面的組織結(jié)構(gòu)和功能信息，有助于理解細(xì)胞群體行為和器官水平的功能整合。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Sundar S, Jin T, Liu YH, Chen Z, Reiss M, Kurnikov A, Subochev P, Razansky D. Integrated two-photon and optoacoustic microscopy for functional neuroimaging. Sci Rep. 2025 Jul 1;15(1):20793.
重要發(fā)現(xiàn)
01核心貢獻(xiàn)：高速、大體積活體深組織三維成像
本研究的核心貢獻(xiàn)在于創(chuàng)造性地將雙光子激發(fā)（2PE）技術(shù)與光片照明（Light-sheetillumination）相結(jié)合，構(gòu)建了一種新型顯微鏡系統(tǒng)——雙光子光片顯微鏡（2P-LSM）。這一技術(shù)突破性地解決了在活體組織中，特別是在大腦皮層下深層區(qū)域，進(jìn)行高速、大范圍三維成像的難題。傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡受限于點(diǎn)掃描方式，成像速度慢且光毒性高；而傳統(tǒng)單光子光片顯微鏡則難以穿透深層組織。2P-LSM則兼具了雙光子激發(fā)的深層穿透、光學(xué)層析能力和光片照明的高速、低光毒性?xún)?yōu)勢(shì)。
02關(guān)鍵光學(xué)技術(shù)與成像過(guò)程
雙光子激發(fā)（2PE）原理應(yīng)用：系統(tǒng)利用近紅外飛秒脈沖激光作為激發(fā)光源。雙光子激發(fā)過(guò)程要求熒光分子同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）光子，達(dá)到激發(fā)態(tài)。
這帶來(lái)了顯著優(yōu)勢(shì)：激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)（通常在~1000-1300nm范圍），散射更少，穿透深度顯著增加；激發(fā)只發(fā)生在物鏡焦平面附近一個(gè)極小的體積內(nèi)（光學(xué)層析），有效抑制了背景噪聲，提升了成像信噪比（SNR）和對(duì)比度；同時(shí)，長(zhǎng)波長(zhǎng)光子能量較低，對(duì)生物樣本的光損傷和光漂白效應(yīng)大大降低。
光片照明（Light-sheetillumination）實(shí)現(xiàn)：與傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描2PE顯微鏡不同，本研究創(chuàng)新性地將激發(fā)光整形為一片薄而寬的光片。這片光片被側(cè)向投射到樣本中，僅照亮需要成像的焦平面。照明方式從點(diǎn)掃描變?yōu)槊嬲彰�，這是實(shí)現(xiàn)高速成像的關(guān)鍵。
高速三維成像流程：
光片生成與投射：近紅外飛秒激光經(jīng)過(guò)光束整形光學(xué)元件（如柱面鏡組）形成薄光片。
樣本照明：該光片從側(cè)面入射，照亮樣本內(nèi)部一個(gè)特定的焦平面（XY平面）。
熒光信號(hào)收集：位于照明光路垂直方向的另一套高數(shù)值孔徑（NA）物鏡收集被光片激發(fā)的樣本自發(fā)熒光或標(biāo)記熒光信號(hào)。
面探測(cè)：收集的熒光信號(hào)被傳輸?shù)礁咚�、高靈敏度的相機(jī)（如sCMOS相機(jī)）進(jìn)行探測(cè)。相機(jī)一次曝光即可獲取整個(gè)照明焦平面（一個(gè)光學(xué)切片）的圖像，速度遠(yuǎn)快于點(diǎn)掃描。
三維層析：通過(guò)精密地沿Z軸（深度方向）移動(dòng)樣本或物鏡，使光片依次照亮相鄰的不同焦平面。對(duì)每個(gè)焦平面進(jìn)行高速面探測(cè)成像，最終將這些二維切片圖像組合起來(lái)，即可重構(gòu)出樣本的三維結(jié)構(gòu)。
動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)：快速重復(fù)上述三維成像過(guò)程，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)活體樣本內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程（如血流、鈣信號(hào)）的高速三維電影拍攝。
研究者們利用2P-LSM系統(tǒng)對(duì)活體小鼠大腦進(jìn)行了深入成像研究。
穿透深度與分辨率：實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠大腦皮層下超過(guò)600微米深度的清晰成像，分辨率達(dá)到亞細(xì)胞水平（橫向~1μm，軸向~5μm），清晰分辨了深層神經(jīng)元胞體、樹(shù)突棘以及精細(xì)的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這顯著超越了傳統(tǒng)單光子光片顯微鏡在活體組織中的穿透極限。
成像速度與范圍：系統(tǒng)能以高達(dá)10Hz的體積速率（即每秒完成10次完整的三維體積掃描）對(duì)數(shù)百微米尺度的組織體積進(jìn)行成像。例如，可以在數(shù)秒內(nèi)完成對(duì)整個(gè)小鼠丘腦區(qū)域（~600x600x600μm³）的高分辨率三維成像。
活體動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)：成功捕捉了活體小鼠大腦深層區(qū)域（如丘腦、下丘腦）的多種快速動(dòng)態(tài)生理過(guò)程。
神經(jīng)元活動(dòng)：利用基因編碼鈣指示劑（如GCaMP6），實(shí)時(shí)記錄了深層神經(jīng)元群體在數(shù)十赫茲頻率下的鈣瞬變活動(dòng)，揭示了神經(jīng)回路的活動(dòng)模式。
血流動(dòng)力學(xué)：通過(guò)注射熒光染料（如FITC-葡聚糖）標(biāo)記血漿，清晰成像并量化了深層毛細(xì)血管網(wǎng)中的紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡和速度，以及血管直徑的瞬時(shí)變化。
免疫細(xì)胞行為：觀(guān)察到小膠質(zhì)細(xì)胞在深層腦區(qū)的動(dòng)態(tài)形態(tài)變化和遷移行為。
低光損傷驗(yàn)證：長(zhǎng)時(shí)間成像實(shí)驗(yàn)表明，與點(diǎn)掃描2PE相比，2P-LSM在相同成像深度和分辨率下，顯著降低了光漂白和光毒性，使得對(duì)同一活體區(qū)域進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間（數(shù)小時(shí)）重復(fù)觀(guān)測(cè)成為可能，這對(duì)研究長(zhǎng)期生理過(guò)程至關(guān)重要。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論明確：雙光子光片顯微鏡（2P-LSM）是一種強(qiáng)大的活體三維成像工具，它成功結(jié)合了雙光子激發(fā)的深層穿透、光學(xué)層析能力和光片照明的高速、低光毒性?xún)?yōu)勢(shì)，首次實(shí)現(xiàn)了在活體哺乳動(dòng)物大腦皮層下深層區(qū)域進(jìn)行高速（Hz級(jí)體積速率）、大范圍（百微米級(jí)體積）、高分辨率（亞細(xì)胞水平）的三維動(dòng)態(tài)成像，為神經(jīng)科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究開(kāi)辟了新視野。
創(chuàng)新與亮點(diǎn)
01突破核心難題
本研究的首要亮點(diǎn)在于成功突破了活體深組織高速三維動(dòng)態(tài)成像的長(zhǎng)期瓶頸。在活體組織中，尤其是哺乳動(dòng)物大腦內(nèi)部，強(qiáng)烈的光散射嚴(yán)重限制了光學(xué)成像的深度和分辨率；高速成像需求與低光毒性以避免損傷活體樣本之間存在矛盾；傳統(tǒng)點(diǎn)掃描方式速度慢，難以捕捉快速生理過(guò)程。2P-LSM通過(guò)融合雙光子激發(fā)和光片照明，巧妙地解決了這一系列相互制約的難題：近紅外雙光子激發(fā)穿透更深、背景更低；光片照明實(shí)現(xiàn)高速面探測(cè)；兩者結(jié)合顯著降低了單位像素的光劑量，減輕了光損傷。
將雙光子激發(fā)與光片照明相結(jié)合是本研究的核心技術(shù)創(chuàng)新。此前，這兩種技術(shù)主要獨(dú)立發(fā)展。研究者們解決了關(guān)鍵的技術(shù)挑戰(zhàn)，如高效生成適用于雙光子激發(fā)的薄而均勻的近紅外光片，設(shè)計(jì)緊湊的光路實(shí)現(xiàn)光片側(cè)向入射與熒光信號(hào)垂直收集的幾何構(gòu)型，以及優(yōu)化系統(tǒng)以匹配高速相機(jī)的探測(cè)能力。這種融合并非簡(jiǎn)單疊加，而是創(chuàng)造了一種性能遠(yuǎn)超各自獨(dú)立應(yīng)用的新型成像模態(tài)。
03顯著性能提升與獨(dú)特價(jià)值
無(wú)與倫比的成像深度與分辨率：在活體哺乳動(dòng)物腦組織中穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)600微米以上的高分辨率（亞細(xì)胞水平）成像，這是傳統(tǒng)光片顯微鏡難以企及的深度。
革命性的成像速度：體積成像速率達(dá)到Hz級(jí)別（例如10Hz），比傳統(tǒng)點(diǎn)掃描雙光子顯微鏡快數(shù)十倍甚至百倍，能夠清晰捕捉神經(jīng)元放電、血流等快速生理事件的三維動(dòng)態(tài)。
極低的光毒性：結(jié)合了雙光子激發(fā)的內(nèi)在層析性和光片照明的并行照明優(yōu)勢(shì)，顯著降低了單位體積和單位時(shí)間的光劑量，使得長(zhǎng)時(shí)間、重復(fù)的活體觀(guān)測(cè)成為現(xiàn)實(shí)，特別適合發(fā)育生物學(xué)和長(zhǎng)期行為研究。
大成像范圍：能夠一次性對(duì)數(shù)百微米尺度的組織體積進(jìn)行成像，提供更全面的組織結(jié)構(gòu)和功能信息，有助于理解細(xì)胞群體行為和器官水平的功能整合。
04廣泛的應(yīng)用價(jià)值
這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)值遠(yuǎn)不止于神經(jīng)科學(xué)。它為解決生物醫(yī)學(xué)研究中需要在活體、深層組織內(nèi)進(jìn)行高速、高分辨率三維觀(guān)測(cè)的難題提供了通用平臺(tái)：
神經(jīng)科學(xué)：深入研究皮層下核團(tuán)（如丘腦、下丘腦、基底節(jié)）在感覺(jué)處理、運(yùn)動(dòng)控制、睡眠覺(jué)醒、情緒記憶等高級(jí)功能中的作用，解析深部神經(jīng)回路動(dòng)態(tài)。
血管生物學(xué)：在體定量研究深層微循環(huán)的血流動(dòng)力學(xué)、血管調(diào)節(jié)、血管新生以及血腦屏障功能。
免疫學(xué)：實(shí)時(shí)觀(guān)察免疫細(xì)胞（如小膠質(zhì)細(xì)胞、外周浸潤(rùn)免疫細(xì)胞）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)深層區(qū)域的巡邏、激活和相互作用。
腫瘤研究：監(jiān)測(cè)深層腫瘤微環(huán)境中的血管生成、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、腫瘤細(xì)胞遷移和藥物輸送過(guò)程。
發(fā)育生物學(xué)：追蹤胚胎或器官發(fā)育過(guò)程中深層組織的細(xì)胞行為和組織形態(tài)發(fā)生。
總結(jié)與展望
本研究成功開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了雙光子光片顯微鏡（2P-LSM），這一創(chuàng)新技術(shù)將雙光子激發(fā)的深層穿透、光學(xué)層析能力與光片照明的高速、低光毒性?xún)?yōu)勢(shì)完美融合，首次實(shí)現(xiàn)了在活體哺乳動(dòng)物大腦皮層下深層區(qū)域（>600μm）進(jìn)行高速（Hz級(jí)體積速率）、大范圍（百微米級(jí)體積）、高分辨率（亞細(xì)胞水平）的三維動(dòng)態(tài)成像。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)成像方法在深度、速度和光損傷方面的限制，為清晰揭示活體深部組織（如丘腦、下丘腦）中神經(jīng)元活動(dòng)、血管網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)和免疫細(xì)胞行為等關(guān)鍵生理過(guò)程提供了前所未有的強(qiáng)大工具，極大地推動(dòng)了神經(jīng)科學(xué)、血管生物學(xué)及相關(guān)疾病研究的進(jìn)展。
展望未來(lái)，該技術(shù)仍有優(yōu)化空間，例如通過(guò)自適應(yīng)光學(xué)進(jìn)一步校正組織像差以提升更深層的成像質(zhì)量，開(kāi)發(fā)多色甚至多光子版本以同時(shí)觀(guān)測(cè)更多生物指標(biāo)，結(jié)合行為學(xué)裝置研究自由活動(dòng)動(dòng)物，以及探索在其它器官（如心臟、腎臟、腫瘤）深部成像的應(yīng)用。隨著技術(shù)的不斷成熟和應(yīng)用范圍的拓展，雙光子光片顯微鏡有望成為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的利器，持續(xù)為理解復(fù)雜生命系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)奧秘提供關(guān)鍵洞察。
論文信息聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Sundar S, Jin T, Liu YH, Chen Z, Reiss M, Kurnikov A, Subochev P, Razansky D. Integrated two-photon and optoacoustic microscopy for functional neuroimaging. Sci Rep. 2025 Jul 1;15(1):20793.
DOI:10.1038/s41598-025-07819-4.
- 近紅外化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)無(wú)創(chuàng)同步監(jiān)測(cè)肝缺血與腎損傷病變
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