自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀在抗生素微生物檢定中（管碟法-三劑量）的應(yīng)用
方案摘要：管碟法是抗生素效價(jià)測(cè)定的 “金標(biāo)準(zhǔn)” 之一，其核心在于通過(guò) “平行線原理” 實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的精準(zhǔn)對(duì)比，雖操作繁瑣，但能直接反映抗生素的生物活性，在藥品質(zhì)量控制中具有不可替代的地位。為提升檢測(cè)效率，本方案使用了自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，設(shè)定好程序之后即可一鍵判讀出抑菌圈的直徑，有效減少人工誤差，提高檢測(cè)效率。
方案詳情：
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① 自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀；
② 平底雙碟；
③ 不銹鋼小管。
2、試劑和材料
① 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）懸液；
② 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）懸液；
③ 金黃色葡萄球菌（Szaphylococcus aureus）懸液；
④ 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）懸液；
⑤ 大腸埃希菌（Escherichia coli）懸液；
⑥ 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）懸液；
⑦ 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）懸液；
⑧ 支氣管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）懸液。
⑨ 營(yíng)養(yǎng)瓊脂。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備以及標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存，應(yīng)照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)的規(guī)定。臨用時(shí)照表1的規(guī)定進(jìn)行稀釋。
2、供試品溶液的制備：精密稱(chēng)（或量）取供試品適量，用各品種項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解后，再按估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量照表1的規(guī)定稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛取?br />
注：① 兩性霉素B雙碟的制備，用菌層15ml代替兩層。
② 乙酰螺旋霉素，抗II檢定培養(yǎng)基制備時(shí)，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為8.0～8.2。
③ 含3%氯化鈉。
④ 加0.3%葡萄糖。
3、標(biāo)準(zhǔn)品的品種、分子式及理論計(jì)算值見(jiàn)表2。
4、雙碟的制備： 取直徑約90mm，高16～17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基（表1）20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)面上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量(能得清晰的抑菌圈為度。三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm)，搖勻，在每1雙碟中分別加入5mL，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺(tái)上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置6個(gè)不銹鋼小管(內(nèi)徑為6.0mm±0.1mm，高為10.0mm±0.1mm，外徑為7.8mm±0.1mm)，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。
5、取照上述方法制備的雙碟不得少于6個(gè)，在每1雙碟中間隔的3個(gè)不銹鋼小管中分別滴裝高濃度(S3)、中濃度(S2)及低濃度(S1)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余3個(gè)小管中分別滴裝相應(yīng)的高、中、低三種濃度的供試品溶液；高、低濃度的劑距為1∶0.8。
四、結(jié)果判定
將在規(guī)定條件下培養(yǎng)后的雙碟，放入菌落計(jì)數(shù)儀內(nèi)，啟動(dòng)抑菌圈測(cè)定軟件，一鍵即可測(cè)量出各個(gè)抑菌圈直徑(或面積)，測(cè)量結(jié)果可以直接在屏幕顯示或傳輸?shù)紼XCEL文件。
方案詳情：
- 實(shí)驗(yàn)原理
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① 自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀；
② 平底雙碟；
③ 不銹鋼小管。
2、試劑和材料
① 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）懸液；
② 短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）懸液；
③ 金黃色葡萄球菌（Szaphylococcus aureus）懸液；
④ 藤黃微球菌（Micrococcus luteus）懸液；
⑤ 大腸埃希菌（Escherichia coli）懸液；
⑥ 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）懸液；
⑦ 肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）懸液；
⑧ 支氣管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）懸液。
⑨ 營(yíng)養(yǎng)瓊脂。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備以及標(biāo)準(zhǔn)品的使用和保存，應(yīng)照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)的規(guī)定。臨用時(shí)照表1的規(guī)定進(jìn)行稀釋。
2、供試品溶液的制備：精密稱(chēng)（或量）取供試品適量，用各品種項(xiàng)下規(guī)定的溶劑溶解后，再按估計(jì)效價(jià)或標(biāo)示量照表1的規(guī)定稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)臐舛取?br />
注：① 兩性霉素B雙碟的制備，用菌層15ml代替兩層。
② 乙酰螺旋霉素，抗II檢定培養(yǎng)基制備時(shí)，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為8.0～8.2。
③ 含3%氯化鈉。
④ 加0.3%葡萄糖。
3、標(biāo)準(zhǔn)品的品種、分子式及理論計(jì)算值見(jiàn)表2。
4、雙碟的制備： 取直徑約90mm，高16～17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基（表1）20ml，使在碟底內(nèi)均勻攤布，放置水平臺(tái)面上使凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量(能得清晰的抑菌圈為度。三劑量法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm)，搖勻，在每1雙碟中分別加入5mL，使在底層上均勻攤布，作為菌層。放置在水平臺(tái)上冷卻后，在每1雙碟中以等距離均勻安置6個(gè)不銹鋼小管(內(nèi)徑為6.0mm±0.1mm，高為10.0mm±0.1mm，外徑為7.8mm±0.1mm)，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。
5、取照上述方法制備的雙碟不得少于6個(gè)，在每1雙碟中間隔的3個(gè)不銹鋼小管中分別滴裝高濃度(S3)、中濃度(S2)及低濃度(S1)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余3個(gè)小管中分別滴裝相應(yīng)的高、中、低三種濃度的供試品溶液；高、低濃度的劑距為1∶0.8。
四、結(jié)果判定
將在規(guī)定條件下培養(yǎng)后的雙碟，放入菌落計(jì)數(shù)儀內(nèi)，啟動(dòng)抑菌圈測(cè)定軟件，一鍵即可測(cè)量出各個(gè)抑菌圈直徑(或面積)，測(cè)量結(jié)果可以直接在屏幕顯示或傳輸?shù)紼XCEL文件。
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