避暗實驗又稱"步入法"（step-through test），是由J.B. Overton和D.S. Chamberlain在20世紀(jì)60年代末期開發(fā)的行為學(xué)范式。其核心設(shè)計基于嚙齒類動物作為夜行性動物的天然嗜暗特性，通過將這種先天偏好與厭惡刺激（如適度電擊）相結(jié)合，形成被動回避條件反射，從而評估動物的學(xué)習(xí)記憶能力。

與主動回避范式相比，避暗實驗具有應(yīng)激水平相對較低、操作簡便、實驗周期短等優(yōu)勢，被廣泛用于初步藥物篩選和遺傳學(xué)研究。特別是2020年以來，隨著光遺傳學(xué)、鈣成像技術(shù)和深度學(xué)習(xí)行為分析的應(yīng)用，避暗實驗的神經(jīng)機制解析度和行為評估精度顯著提高。本文系統(tǒng)梳理了避暗實驗的原理、流程與應(yīng)用前沿，以期為相關(guān)領(lǐng)域研究者提供全面的方法學(xué)參考。

避暗實驗的行為學(xué)原理基于嚙齒類動物的嗜暗天性（scototaxis）與回避學(xué)習(xí)（avoidance learning）的結(jié)合。在自然狀態(tài)下，小鼠和大鼠表現(xiàn)出對黑暗環(huán)境的明顯偏好，在明暗箱中選擇停留在暗室的時間通常占60%以上。這種偏好被認(rèn)為是一種進化適應(yīng)的生存策略，因為黑暗環(huán)境為夜行性嚙齒動物提供更多保護。

實驗通過在這種天性行為基礎(chǔ)上施加厭惡刺激（暗室電擊），使動物形成"暗室-電擊"的關(guān)聯(lián)記憶。一旦這種關(guān)聯(lián)形成，動物會抑制其進入暗室的自然傾向，表現(xiàn)為進入暗室的潛伏期延長和錯誤次數(shù)減少。這種被動回避反應(yīng)屬于條件反射的一種形式，與主動回避（如穿梭箱）相比，它要求動物抑制某種行為而不是發(fā)起新行為。

避暗實驗?zāi)軌騾^(qū)分記憶處理的三個關(guān)鍵階段：

• 記憶獲得（acquisition）：訓(xùn)練階段動物學(xué)習(xí)"暗室-電擊"關(guān)聯(lián)的過程，可通過訓(xùn)練前給藥干擾

• 記憶鞏固（consolidation）：訓(xùn)練后記憶從短期存儲轉(zhuǎn)為長期存儲的過程，可通過訓(xùn)練后立即給藥干擾

• 記憶再現(xiàn)（retrieval）：測試階段動物提取和表達已存儲記憶的過程，可通過測試前給藥干擾

這種階段性特征使避暗實驗?zāi)軌蚓�細解析不同藥物或病理條件對特定記憶過程的影響。

避暗實驗中的學(xué)習(xí)記憶過程依賴于多腦區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同工作。研究表明：

• 海馬體：在空間記憶和情境記憶編碼中起核心作用，特別是CA1區(qū)神經(jīng)元活動與回避行為密切相關(guān)

• 前額葉皮層：尤其是背內(nèi)側(cè)前額葉皮層（dmPFC），參與恐懼記憶的提取和決策制定

• 杏仁核：在恐懼情感記憶的形成和表達中起關(guān)鍵作用

• 膽堿能系統(tǒng)：基底前腦膽堿能神經(jīng)元投射至海馬和皮層，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶過程

在分子機制層面，NMDA受體、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）信號通路對避暗記憶的形成和存儲至關(guān)重要。

現(xiàn)代避暗實驗系統(tǒng)通常由以下幾個核心組件構(gòu)成：

• 測試箱體：分為明室和暗室兩個區(qū)域，大小因動物種類而異。小鼠測試箱一般為27cm×16cm×20cm（長×寬×高），大鼠為48cm×24cm×30cm。明室通常采用白色塑料材質(zhì)并設(shè)有強光照明（≥1000 lux），暗室采用黑色密閉材料。

• 電刺激系統(tǒng)：暗室底部設(shè)有銅柵欄，可通電流產(chǎn)生足部電擊。小鼠推薦電流參數(shù)為0.15-0.6mA（常用0.25mA）或電壓30-36V，頻率5-15Hz。

• 自動監(jiān)測系統(tǒng)：包括紅外探測器、視頻追蹤系統(tǒng)和自動控制軟件（如SuperPas、VisuTrack等），可自動記錄潛伏期、錯誤次數(shù)、運動軌跡等參數(shù)。
  
  3.2 實驗動物準(zhǔn)備

• 動物選擇：常用C57BL/6J品系小鼠（8-12周齡），體重20-30g。避免使用視力障礙或運動缺陷個體。

• 適應(yīng)性飼養(yǎng)：實驗前3-7天將動物移至行為實驗室適應(yīng)環(huán)境，維持12/12小時光暗周期，溫度22-25℃。

• 習(xí)慣化處理：實驗前每天對動物進行5-10分鐘輕柔安撫，降低因操作引起的應(yīng)激反應(yīng)。

• 預(yù)篩選：正式實驗前進行明暗偏好測試，剔除在暗室停留時間不足60%或潛伏期超過180秒的個體。

• 3.3 標(biāo)準(zhǔn)化實驗流程

  避暗實驗通常分為三個階段進行，總周期約2-3天：

  階段一：適應(yīng)期（第1天）

• 將小鼠頭朝室壁放入明室，兩室之間的門洞敞開

• 階段二：訓(xùn)練期（第1天，適應(yīng)后1小時）

• 將小鼠放入明室，自動計時開始

• 當(dāng)動物進入暗室時，關(guān)閉門洞并施加足部電擊（0.3-0.5mA，持續(xù)2-3秒）

• 電擊后保持暗室封閉30秒以強化記憶聯(lián)系

• 記錄動物電擊反應(yīng)：A級（劇烈嘶叫并跳躍）、B級（微弱尖叫）、C級（無叫聲但跳躍）

• 階段三：測試期（第2天，訓(xùn)練后24小時）

• 將小鼠再次放入明室，不施加電擊

• 記錄5分鐘內(nèi)首次進入暗室的潛伏期（最大300秒）

• 記錄錯誤次數(shù)（進入暗室次數(shù)）和各室停留時間
  
  3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

  關(guān)鍵數(shù)據(jù)分析指標(biāo)包括：

• 避暗潛伏期（step-through latency, STL）：動物首次進入暗室的時間，反映記憶保持強度

• 錯誤次數(shù)：5分鐘內(nèi)進入暗室的總次數(shù)，反映記憶準(zhǔn)確性

• 明/暗室停留時間：在各室停留的時間比例，反映空間偏好變化

• 運動路程：總運動距離，反映一般活動水平

• 統(tǒng)計方法采用t檢驗或單因素方差分析（one-way ANOVA），多組比較采用Fisher's LSD事后檢驗，顯著性水平設(shè)為p<0.05。

  4 應(yīng)用范圍
  4.1 神經(jīng)退行性疾病研究

  避暗實驗廣泛應(yīng)用于阿爾茨海默病（AD）模型動物的認(rèn)知功能評價。研究表明：

• APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在測試期中避暗潛伏期顯著縮短（45.2±12.3秒 vs 對照組112.6±28.7秒），錯誤次數(shù)增加2倍以上（p<0.01）

• Aβ蛋白沉積與記憶障礙嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，潛伏期縮短程度可反映病理進展

• 膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊處理能顯著改善AD模型小鼠的避暗表現(xiàn)，潛伏期延長至正常水平的80%以上

• 4.2 藥理學(xué)與毒理學(xué)評價

  避暗實驗常用于評估神經(jīng)活性物質(zhì)對認(rèn)知功能的影響：

• 東莨菪堿（膽堿能拮抗劑）：訓(xùn)練前20分鐘注射（1-3mg/kg）可使?jié)摲�期縮短50%以上，錯誤次數(shù)增加2-3倍，模擬記憶獲得障礙

• 乙醇（記憶再現(xiàn)干擾劑）：測試前15分鐘灌胃（35%，0.1ml/10g）可使?jié)摲�期�?80±15秒降至92±24秒， reversibly抑制記憶提取

• 亞硝酸鈉（記憶鞏固干擾劑）：訓(xùn)練后立即注射（90mg/kg）導(dǎo)致30-48小時后記憶表現(xiàn)顯著受損

• 4.3 記憶機制研究

  通過避暗實驗與其他技術(shù)的結(jié)合，研究人員揭示了記憶過程的多種神經(jīng)機制：

• 光遺傳學(xué)研究：抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元活動使工作記憶錯誤增加2.3倍，而不影響參考記憶

• 光纖記錄研究：發(fā)現(xiàn)dmPFC-BLA（背內(nèi)側(cè)前額葉皮層-基底外側(cè)杏仁核）通路在主動回避中激活，而dmPFC-DMS（背內(nèi)側(cè)紋狀體）通路在被動回避中更活躍

• 分子生物學(xué)研究：CREB敲除小鼠顯示避暗記憶鞏固缺陷，而BDNF過表達小鼠表現(xiàn)增強的記憶保持

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• 讓動物在明暗兩室內(nèi)自由探索2-3分鐘

• 取出放回飼養(yǎng)籠，不清洗設(shè)備以保留氣味線索