不同應(yīng)用的正確解決方案

激光顯微解割（LMD）系統(tǒng)有許多不同類型的耗材。它們涵蓋了從基礎(chǔ)到高度專業(yè)化的廣泛應(yīng)用，使科學家能夠根據(jù)自己的研究領(lǐng)域選擇個性化的配置。

最常見的耗材是各種玻璃膜載玻片，結(jié)合標準蓋子以收集解剖樣本。還使用框架載玻片、帶和不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿、Ibidi 載玻片和多室培養(yǎng)載玻片。此外，徠卡 LMD 系統(tǒng)的靈活軟件設(shè)置允許使用自制或定制的標本載體或激光微切割的收集裝置。

一般來說，徠卡顯微系統(tǒng)提供演示載玻片套件，其中包含不同類型的載玻片，以測試不同應(yīng)用的不同可用膜，以找到最適合任何應(yīng)用的膜載玻片。特別是對于熒光，測試不同的載玻片可以讓你的生活更輕松。例如，PPS 相比于 PEN 具有更少的自發(fā)熒光，但 POL 或 PET 也可能適合你的熒光染料。

眼見為實，用于嘗試、觀察并相信！

LMD樣本設(shè)備

玻璃膜載玻片

用于激光顯微切割的特殊膜安裝在玻璃載玻片上，以實現(xiàn)最高質(zhì)量的結(jié)果。覆蓋有高UV吸收膜的玻璃載玻片，特別適合冷光照射（蒸發(fā)），稱為玻璃膜載玻片。此類型的載玻片在圖 1a 的左側(cè)顯示。

膜應(yīng)用于玻璃載玻片的上表面，膜的邊緣與玻璃粘合。因此，創(chuàng)建了一個矩形區(qū)域用于安裝標本，其中膜與玻璃基底之間有空氣。膜經(jīng)過特殊涂層處理，以確保標本的最佳粘附。

一般來說，玻璃膜載玻片在膜輔助激光顯微切割（LMD）中具有多種應(yīng)用潛力，并配有不同應(yīng)用的各種涂層。

小心處理薄膜對于避免膜損壞至關(guān)重要。應(yīng)避免玻璃與膜之間的水分積聚，因為這可能導致切割物粘附在玻璃基底上。玻璃載玻片有兩種不同的膜類型：

• PPS（聚苯硫醚）

• PEN（聚乙烯萘）

圖 1a - 1c 分別展示了用于電機臺、掃描臺或 ITK LMT350 超臺的標準樣品架，放置了不同的載玻片。圖 1 顯示了一個玻璃載玻片（左）、一個框架載玻片（中）和一個 Ibidi®載玻片（右）。

圖 1a：電機臺的樣品架

圖 1b：掃描臺的樣品架

圖 1c：LMT350 超階段的標本架

PEN 和 PPS 膜載玻片

（載玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用區(qū)域 19 x 41 mm）

標準載玻片具有 PEN 膜。這些膜可以用于大多數(shù)LMD應(yīng)用，除了在植物研究中使用的極高激光能量。例如，PEN 膜有兩種不同的厚度：2.0 µm 或 4 µm。4 µm 是一種特殊的發(fā)明，旨在與徠卡 LMD系統(tǒng)結(jié)合使用：該膜比 2 µm 標準膜更強，便于切片安裝，并在安裝過程中降低膜受損的風險，且膜本身更重，因此更容易通過重力收集。

PEN 膜片也有經(jīng)過認證的 RNase 和 DNase 自由版本，以保證在 DNA 和 RNA 研究中無污染的工作。與 PEN 膜片一樣，PPS 涂層膜片也可以在幾乎所有激光輔助顯微切割技術(shù)中使用。PPS 膜片的自發(fā)熒光較少，表面結(jié)構(gòu)比 PEN 膜片更光滑，但在化學處理（例如，二甲苯）方面的耐受性不如 PEN 膜片。當使用玻璃片時，重要的是將其放入標本架中，組織面朝下。否則，所需區(qū)域?qū)⒈磺懈�，但會掉落在膜和捕獲裝置之間的玻璃底座上，而不是被捕獲在收集容器中。

大型 PEN 和 PPS 載玻片

（載玻片尺寸：52 x 76 mm，LMD 可用區(qū)域 39 x 45 mm）

這些是用于特別大標本的 PEN 或 PPS 膜玻璃載玻片，例如在神經(jīng)科學中使用的組織切片�？商峁┨厥獾臉吮緤A用于顯微解剖。大玻璃載玻片可見于圖 2a 和 2b。

圖 2a 和 2b：該標本夾可用于大型 PEN 或 PPS 載玻片以及培養(yǎng)皿（參見圖 10a）。

框架載玻片

（載玻片尺寸：26 x 76 mm，LMD可用區(qū)域 16 x 45 mm）

框架載玻片由金屬框架組成，可以覆蓋各種膜（圖 4b）。此類型載玻片可用的膜如下：

• PEN（聚對苯二甲酸萘酯）

• PPS（聚苯硫醚）

• PET（聚對苯二甲酸乙二醇酯）

• POL（聚酯）

• FLUO（氟碳）

結(jié)合特殊的 150 倍干式物鏡（圖 3），它在不需要浸油的情況下提供亞細胞分辨率，框架載玻片非常適合單細胞和染色體應(yīng)用。當使用框架載玻片時，解剖樣本直接粘附在箔片上，因此特別適合于極小樣本的解剖，例如染色體解剖�？蚣苤�撐具有凸起的表面結(jié)構(gòu)，恰好適合框架載玻片前部的凹 cavity，便于將組織切片固定到膜上。這創(chuàng)造了一個平坦的表面并支撐膜�？蚣苤�撐在某種程度上形成了膜的骨架，為在樣本準備過程中將樣本施加到膜上提供了足夠的阻力和張力（圖 4）

圖 3：150 倍干式物鏡，專為與 POL 膜載玻片結(jié)合而設(shè)計，用于解剖每一個微小樣本。

然而，框架滑片可以在沒有框架支撐的情況下用于安裝組織切片。

像適當涂層的玻璃膜滑片一樣，帶有 PPS 膜的框架滑片幾乎可以用于任何應(yīng)用。

而帶有 POL 膜的框架滑片主要用于染色體解剖（Post 等，MolEcoNotes，2006），結(jié)合 150 倍干物鏡，帶有 PET 膜的框架滑片則非常適合后續(xù)的質(zhì)譜分析技術(shù)（Drummond 等，Acta Neuropathol 2017）。與其他可用膜相比，PET 幾乎不含增塑劑，這些增塑劑可以通過 HPLC 與蛋白質(zhì)分離。這些增塑劑可能會阻塞部分質(zhì)譜圖譜，使得某些頻帶無法在被阻塞的頻譜區(qū)域中觀察到。類似的現(xiàn)象也可以在用于收集的 PCR 管中觀察到。

特殊的 FLUO 膜特別適合熒光、PH 和真正的DIC。

圖 4：帶有膜和框架支撐的金屬框架作為“骨干”。

框架載玻片也可以用作活細胞培養(yǎng)的樣本載體。因此，載玻片的矩形腔體被用作培養(yǎng)皿。建議在這種培養(yǎng)中，將載玻片放入更大的培養(yǎng)皿中，并在將細胞接種到腔體膜上后完全覆蓋培養(yǎng)基。如果使用 PEN 膜，培養(yǎng)細胞的形態(tài)不會改變，而其他類型的膜可能會由于不同膜的表面特性導致培養(yǎng)細胞的形態(tài)不同。

可以為難以附著在膜上的樣本創(chuàng)建兩個框架滑片的夾層：簡單地將樣本夾在兩個框架的膜之間，激光足夠強大，可以切割這樣的夾層堆疊。液滴或涂抹制備也可以輕松應(yīng)用于使用框架滑片的激光顯微切割。

對于植物應(yīng)用以及其他硬組織如骨頭、牙齒等，推薦使用框架滑片，因為它們比玻璃滑片更能兼容高激光功率。高激光功率可能會邊緣玻璃，使得附著在其上的材料更難切割。

對于植物樣本如葉子，根本不需要膜載玻片作為載體，因為這種材料可以直接應(yīng)用于激光微切割（Hölscher，Rec Adv Polyphenol Res（2019））。

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激光微切割的采集設(shè)備

蓋子/微量離心管

在LMD解剖后，樣本在重力作用下掉入收集容器，例如標準的薄壁微離心管及其蓋子。不同滑片與蓋子的組合是激光顯微解剖中最常見的應(yīng)用之一。通常使用標準的 0.2 毫升和 0.5 毫升管，蓋子可以是空的（干燥的）或裝有合適的緩沖液或類似的適宜介質(zhì)。例如，蓋子中含有 RNase 抑制劑的溶液可以防止核酸在激光顯微解剖過程后立即分解。同樣，蛋白質(zhì)也可以通過緩沖液保持在穩(wěn)定狀態(tài)�？盏�、干燥的蓋子提供了一種良好的識別解剖樣本的方法，并且可以通過拍攝前后照片進行輕松比較�；�本上，微解剖樣本可以轉(zhuǎn)移到任何標準蓋子上。圖 5a 和 5b 顯示了蓋子和微離心管的匹配收集器。盡管可以使用特殊的 OptiCaps（#11505169），但對于徠卡激光顯微解剖來說，這些并不是必需的。OptiCaps 具有集成的光學元件，以確保最佳的照明均勻性，并且可能是“粘性”的。然而，Leica LMD 系統(tǒng)不需要使用昂貴的非標準管蓋，因為收集過程是重力驅(qū)動的，不需要克服重力。

此外，還有 1.5 毫升的管子，配有硅膠填充的蓋子。在 LMT350 超階段的多收集器中，借助杠桿，這個填充的蓋子可以與膜上的組織接觸。這個設(shè)置有助于收集具有挑戰(zhàn)性的粘性樣本。

還有可能收集到特殊的樣本設(shè)備中，例如用于組織均質(zhì)化、蛋白質(zhì)提取和通過壓力循環(huán)技術(shù)消化的 PCT 微管（PCT, PressureBioSciences Inc.）。直接收集到這些設(shè)備中可以節(jié)省時間，因為不需要重新移液。

圖 5：用于收集蓋子和微量離心管的特殊收集裝置可以用于正常尺寸的 0.2 毫升（a）和 0.5 毫升（b）。收集器直接位于樣本下方，解剖物因重力作用直接落入管蓋中。

適用于 8 孔條、8 孔和 12 孔條蓋以及多孔載玻片（如 18 孔 Ibidi 載玻片或 LOC（實驗室芯片）載玻片的通用支架。

適用于不同收集設(shè)備的通用支架在同一載體中獨特于徠卡，并提供多種不同收集設(shè)備的選項，適用于不同的應(yīng)用。此外，通用支架可調(diào)節(jié)高度，以將所選收集器調(diào)整至靠近標本載體，以實現(xiàn)最小的落距。

8 孔條可用于大容量應(yīng)用（例如，將活細胞收集到培養(yǎng)基中），8 孔條蓋非常適合高通量應(yīng)用。此外，通用支架適合攜帶室內(nèi)載玻片、多孔載玻片以及 LOC（實驗室芯片）設(shè)備，如 Ibidi®載玻片。所有設(shè)備均可用作激光顯微切割的收集設(shè)備。

8條LCC   

這些收集器的開發(fā)旨在提高對解剖活細胞后續(xù)檢查的樣本通量，并可以組合在一起形成 96 孔板。圖 6a 和 6b 各顯示了一個適合的持有器，帶有 8 孔條 LCC，可以組合形成孔板�？装迨沁M行細胞培養(yǎng)高通量篩選的基礎(chǔ)。

使用這樣的篩選技術(shù)，可以在極短的時間內(nèi)分析大量單細胞培養(yǎng)，并在必要時進行再培養(yǎng)。

圖 6a 和 6b：8 孔條作為解剖收集器，使細胞培養(yǎng)的高通量篩選成為可能。

 8 孔和 12 孔條蓋（用于分子生物學/PCR）   

0.2 毫升 8 孔條的蓋子可以用作激光顯微切割的收集器。在激光顯微切割后，8 孔條的蓋子可以放在 0.2 毫升 8 孔條或 96 孔 PCR 板上，直接插入 PCR 機器（可根據(jù)要求提供）。使用 8 孔條在后續(xù) PCR、定量 PCR 或其他加熱或冷卻過程中，特別適合處理大量樣本。

圖 7a 和 7b：8 孔條蓋

可調(diào)高度的 48 孔收集器（圖 8）允許同時使用六個 8 孔條，這樣在一次實驗中以最小的努力就可以輕松填充 96 孔板。

通用支架也適用于其他 LOC 設(shè)備，例如 18 孔 Ibidi®載玻片和用于活細胞培養(yǎng)應(yīng)用的腔室載玻片（圖 9）。任何自制的收集裝置，只要具有載玻片的 x-y 尺寸，也可以與此支架結(jié)合使用。

圖 8：48 孔收集器

圖 9：帶有腔室滑片的通用支架作為收集裝置。

用于 LCC 模式的耗材

有多種與激光解剖、操作和選擇技術(shù)兼容的標本載體，適用于 LCC（活細胞培養(yǎng)）。徠卡提供特定于LMD的耗材用于活細胞處理：

• 培養(yǎng)皿（帶或不帶 PEN 膜）

• Ibidi®滑片（帶或不帶 PEN膜）

這些帶有 PEN 膜的耗材可以作為解剖的標本載體，或者，即使沒有 PEN 膜，也可以作為活細胞激光操作的標本載體，或者作為再培養(yǎng)、克隆或下游分析的收集容器。

框滑片的矩形腔體也可以用于細胞培養(yǎng)（見上文 → 框滑片）。

此外，帶有 PEN 膜的培養(yǎng)皿以及 Ibidi® 滑片可以與常用的收集器（0.5 毫升管、0.2 毫升管、8 孔條、8 條管蓋、Ibidi 滑片、常規(guī)培養(yǎng)皿、多室培養(yǎng)滑片和 96 孔板）結(jié)合使用。

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圖 10a：一個培養(yǎng)皿和一個帶有 PEN 膜的 18 孔 ibidi 載玻片，用于活細胞培養(yǎng)。

培養(yǎng)皿

培養(yǎng)皿通常適合活細胞培養(yǎng)（LCC），并且有帶或不帶 PEN 膜的版本。圖 10b 顯示了已經(jīng)在圖 2a 和 2b 中說明的大型 PEN/PPS 載玻片和培養(yǎng)皿的樣品架；一個帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿已被插入，代替了大型載玻片。圖 10c 顯示了將培養(yǎng)皿用作收集器的情況。

不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿   

（Ø 50 毫米）

不帶 PEN 膜的傳統(tǒng)培養(yǎng)皿用于收集和再培養(yǎng)解剖物。不帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿不能在激光顯微解剖的樣品架中使用，但可以用于活細胞操作實驗。然而，選定區(qū)域可以使用LMD激光進行操作，并通過延時電影功能觀察長時間。

帶 PEN 膜的培養(yǎng)皿   

(Ø 50 mm，適用于LMD的可用區(qū)域 Ø 30 mm)

在帶有 PEN 膜的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細胞可以在 LCC 模式下進行解剖，并轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)皿（帶或不帶 PEN 膜）或其他合適的收集容器中。膜可以涂覆聚-L-賴氨酸或膠原蛋白，以提高粘附性和細胞生長。

Ibidi®載玻片   

（載玻片尺寸：26 x 76 mm，每個孔適用 30 µl 液體 ）

這些載玻片配備了專門設(shè)計用于激光顯微解剖活細胞的孔。每個載玻片有 18 個凹槽，底部為 PEN 膜。

Ibidi® 幻燈片可以與適用于 LCC 模式的所有收集器組合使用。

圖 11a：用于 ibidi 幻燈片的 LMT350 超級臺的幻燈片支架。

另一種無污染的選擇變體是所謂的幻燈片堆疊（圖 11b、11c），由兩個 Ibidi 幻燈片以三明治技術(shù)疊放而成。從這樣的堆疊中解剖的細胞會因重力直接落入下方固定在特殊堆疊支架中的 Ibidi 幻燈片中（圖 11b、11c）。后續(xù)的再培養(yǎng)以及提取細胞的下游分析都是可能的。

匹配的蓋子提供了進一步的污染保護選項。

Ibidi® 幻燈片也可以與通用支架結(jié)合使用，作為 LOC 設(shè)備的收集裝置（圖 11c）。

97-96孔板  

對于需要更高通量的實驗，還有一種解決方案。96 孔標準 PCR 板（半裙邊、無裙邊或全裙邊）使用戶能夠并行收集多達 96 個不同實驗的材料。這些板可以直接放入標準 PCR 機器中。此外，還有用于活細胞的 96 孔板支架，例如用于克隆目的。

還有一個收集器選項，可以直接解剖到由公司Covaris®制造的特殊 96 孔板中，以進行超聲處理。

圖 12a：與 LMT350 超級平臺一起使用的無裙邊 96 孔板作為收集器。圖 12b、12c 和 12d：無裙邊、半裙邊和活細胞 96 孔板的收集支架。

表 1：激光顯微解剖用膜滑片和培養(yǎng)皿 – 根據(jù)膜類型、膜支撐和使用的物鏡比較切割性能。激光顯微解剖性能：– 不適合；+ 滿意；++ 良好；+++ 非常好。ª這些物鏡在與最佳圖像質(zhì)量結(jié)合時，具有改進的光學性能以傳輸 UV 光。D 代表校正環(huán)的位置。

表 2：LMD 耗材與 LMD 階段的兼容性。

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