LIGHTNING和TauSense

如何提高聚焦離子束(FIB)加工的定位精度

LIGHTNING超分辨率檢測和TauSense技術(shù)能夠獲得更好的低溫熒光成像，促進了低溫光電聯(lián)用工作流程。

熒光顯微鏡圖像能夠為cryo-FIB加工提供定位支持，其質(zhì)量決定了所制備薄片的結(jié)果。本文描述了LIGHTNING技術(shù)是如何顯著提高圖像質(zhì)量，以及如何利用該技術(shù)基于熒光壽命的信息來辨別樣品的不同結(jié)構(gòu)。

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學習要點

低溫條件下的超分辨率LIGHTNING技術(shù)

• 該技術(shù)是如何工作的？

• 反卷積是一種較為普遍的技術(shù)，那LIGHTNING有什么特別的地方？

• 使用STELLARIS Cryo共聚焦顯微鏡時，LIGHTNING技術(shù)如何提高樣品定位精度？

• 使用LIGHTNING技術(shù)反卷積后，我可以量化數(shù)據(jù)嗎？

低溫條件下的TauSense技術(shù)

• 什么是TauSense技術(shù)？

• TauSense技術(shù)如何工作?

• TauContrast

• TauScan

• TauSeparation

• TauGating

• 將TauSense技術(shù)完全集成到Coral Cryo軟件的工作流程中

介 紹

冷凍電子斷層掃描技術(shù)(Cryo-ET)是一種透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)，該技術(shù)通過分析一系列傾轉(zhuǎn)圖像，對相對較薄體積的樣品（約200-300 nm厚）進行成像。通過該技術(shù)，可以揭示蛋白質(zhì)的3D分子結(jié)構(gòu)。

隨著近十年來， cryo-FIB和cryo-TEM的樣品制備技術(shù)飛速發(fā)展，已經(jīng)可以實現(xiàn)在細胞內(nèi)部的天然環(huán)境中，使用cryo-ET技術(shù)解析蛋白質(zhì)和其他生物分子的結(jié)構(gòu)，分辨率可達到亞納米級。使用這種方法，細胞需要生長在TEM載網(wǎng)上，再通過投入冷凍將樣品玻璃化，然后轉(zhuǎn)移至冷凍-FIB/SEM加工出小窗口（薄片）。隨后就可以使用cryo-TEM對薄片成像，獲得一系列傾轉(zhuǎn)圖像。細胞的成像窗口必須足夠薄，以便允許電子束穿透樣品。

然而，為了確定樣本中的特定點，需要對感興趣區(qū)域進行高精度地定位。目前，這主要是通過冷凍共聚焦熒光顯微鏡進行3D高精度成像實現(xiàn)的。共聚焦針孔能夠消除了離焦光線，特別是在軸向方向，從而提高分辨率和對比度。

在下文中，解釋了如何在低溫條件下使用LIGHTNING超分辨技術(shù)和TauSense基于熒光壽命的工具，使用熒光顯微鏡更好地辨別和識別目標結(jié)構(gòu)，以便用于后續(xù)的電鏡工作流程。

低溫條件下的超分辨LIGHTNING技術(shù)

該技術(shù)是如何工作的？

盡管共聚焦顯微鏡提供了極好的3D掃描成像質(zhì)量，但在成像過程中仍然會發(fā)生衍射現(xiàn)象，從而限制成像的分辨率。該現(xiàn)象是每個成像系統(tǒng)設(shè)置的特征，可以描述為所謂的點擴散函數(shù)(PSF)。該方法得到的圖像是樣本與成像系統(tǒng)的PSF和設(shè)定條件的卷積（折疊）。衍射現(xiàn)象會產(chǎn)生較為模糊的圖像，導致有效分辨率降低和每一個光子定位偏差。同時，樣品圖像還存在其他干擾信號，如背景和噪聲，影響從原始數(shù)據(jù)中獲得的信息。

然而，現(xiàn)在可以通過精密的模型，從樣品的離焦區(qū)域識別單個光子的干擾信號，然后通過與其原始位置的相關(guān)性對其進行反卷積。通過這種方法可以獲得超分辨率圖像。

反卷積是一種較為普遍的技術(shù)眾所周知的，但什么是特別的那LIGHTNING有什么特別的地方？

共聚焦顯微鏡的傳統(tǒng)反卷積方法，通常使用一個全局設(shè)置進行圖像重建，該過程不考慮圖像中的不均勻性。因此，攜帶信息的信號可能被拒絕，而不需要的信號（如背景或噪聲）可能被錯誤地解釋為信息。

另一方面，LIGHTNING技術(shù)包括位置依賴、精確體素的差異。這種自適應過程能夠全自動、準確地恢復任何生物樣本的信息，即使在低溫條件下的成像結(jié)果（圖1）。

圖1：傳統(tǒng)反卷積和LIGHTNING技術(shù)之間的差異。LIGHTNING技術(shù)標準算法使用一個全局設(shè)置，確定單個體素精確的信號-背景值，以適應每個單個像素，并允許自動批處理。

通過去除不需要的背景信號和噪聲，LIGHTNING技術(shù)能夠提高圖像質(zhì)量。在實際反卷積之前的預處理步驟中，需要確定全局背景值。根據(jù)實際局部信號和噪聲之間的比值，將全局背景微調(diào)至局部背景值中。噪聲可以根據(jù)其高空間頻率進行識別，通過忽略噪聲可以更好地獲得攜帶有信息的信號。

圖2：不應用（上排）和應用LIGHTNING技術(shù)（下排）的共焦Z-堆棧的投影。左圖：感興趣區(qū)域1和感興趣區(qū)域2的概覽圖，參見中心和左側(cè)圖。中間圖：區(qū)域1的放大圖，信號強度如圖所示，不應用和應用LIGHTNING技術(shù)。應用LIGHTNING技術(shù)后，脂滴信號的半高全寬改善，噪聲和背景被清除。左側(cè)圖：管狀結(jié)構(gòu)在應用LIGHTNING技術(shù)后清晰可見，信號強度如圖所示。Sum159細胞，乳腺癌細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy提供。藍色- Hoechst -細胞核，綠色- MitoTracker Green-線粒體，紅色- Bodipy -脂質(zhì)滴。比例尺為5 µm，區(qū)域1的線條長度為1.6 µm，區(qū)域2的線條長度為1.5 µm。

圖2為使用標準共聚焦顯微鏡（上圖）和LIGHTNING超分辨共聚焦（下圖）拍攝的兩個代表性的癌細胞圖像，其中顯示了線粒體（綠色）、脂滴（紅色）和細胞核（藍色）。從對比結(jié)果中可以清楚地看到，LIGHTNING技術(shù)能夠去除背景和噪聲，獲得對比度較高的圖像，更容易識別和辨別目標結(jié)構(gòu)。圖像質(zhì)量的明顯改善，使得識別后續(xù)相關(guān)步驟所需的目標結(jié)構(gòu)變得更為容易。

當在高倍鏡下成像時，LIGHTNING技術(shù)的影響更加明顯，如圖2所示的放大區(qū)域。

如區(qū)域1中的脂滴圖像所示，通過LIGHTNING技術(shù)能夠降低背景和噪聲，從而改善信號，更精確地定向觀察脂滴結(jié)構(gòu)。

在區(qū)域2中所觀察到的管狀結(jié)構(gòu)也得到相同的結(jié)果。LIGHTNING技術(shù)提高了線粒體膜的對比度，使管狀外觀更加清晰，不僅提高了定位效率，而且增強了CLEM光電關(guān)聯(lián)過程的精確度。

使用LIGHTNING技術(shù)反卷積后，我可以量化我的數(shù)據(jù)嗎？

答案是肯定的。生成決策掩碼的過程基于通用圖像處理方法，因此是完全可量化的。整個流程中，沒有改變單個光子的強度或定位特征，以及光子計數(shù)信息。該流程僅從現(xiàn)有共聚焦數(shù)據(jù)中提取信息，不做任何修改。

無論是否使用自適應方法，在重建過程中沒有局部和相對強度失真。通過使用自適應的、基于決策掩模的方法，將產(chǎn)生偽影或丟失信息的概率降至最低。

圖3：共聚焦Z-堆棧的投影。Sum159細胞和乳腺癌細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy提供。藍色- Hoechst -表示細胞核，綠色- MitoTracker Green-線粒體，紅色- Bodipy -脂質(zhì)滴。

低溫條件下的TauSense技術(shù)

什么是TauSense技術(shù)？

TauSense 技術(shù)是一個利用基于熒光壽命的信息的工具集。因此，它為理解細胞功能提供了額外的信息。此外，TauSense技術(shù)可以提高圖像質(zhì)量，并擴展區(qū)分給定標本中熒光基團的能力。TauSense技術(shù)可在應用與室溫樣品和冷凍玻璃化樣品。

TauSense技術(shù)如何工作?

熒光產(chǎn)生過程中存在一個內(nèi)在現(xiàn)象，即熒光基團的激發(fā)與其光子發(fā)射之間具有特定時間間隔。因此，就可以利用脈沖激光激發(fā)樣品中的熒光基團，測量探測器處的光子到達的時間（圖4）。

圖4：TauSense技術(shù)：脈沖激光激發(fā)熒光基團，并確定激光脈沖與光子到達探測器之間的時間。時間間隔被稱為tau或熒光壽命。使用TauSense技術(shù)，確定平均到達時間(AAT)。

上述時間間隔被稱為熒光壽命。熒光壽命取決于熒光基團種類及其微環(huán)境。將兩個（或多個）熒光源的貢獻進行分開的能力，使TauSense技術(shù)成為生命科學的強大分析工具。使用TauSense技術(shù)，能夠確定光子的到達時間，并開發(fā)為一個額外的維度，允許觀察微環(huán)境變化和多通道熒光基團。

TauContrast

TauSense計算每個獨立像素的平均到達時間(AAT)，并通過標準強度圖像之外的不同顏色將其顯示為另一個維度。TauContrast具有特定的熒光壽命強度圖（LUT；圖5）。

圖5：用TauContrast技術(shù)研究硅藻。標準共聚焦圖像：樣品的熒光強度圖像。TauContrast技術(shù): 熒光壽命強度圖表示光子平均到達時間。較短的到達時間為藍色，較長的為黃色至紅色。TauContrast技術(shù)所得結(jié)果顯示了不同的結(jié)構(gòu)，可以區(qū)分出兩個終生組分：組分1為葉綠體的自發(fā)熒光，< 1 ns，組分2在平均到達時間約2.7 ns處為LifeAct-GFP信號。

樣本由德國TU Dresden，B CUBE的Nicole Poulsen提供。

藍色范圍顯示較短的AATs，紅色顯示較長的值。因此，可以從圖像中立即直觀地區(qū)分不同的AATs。通常，反射和某些類型的自發(fā)熒光在1 ns以下用“較短”的AATs表示，而熒光蛋白產(chǎn)生的靶信號的AATS則在1 ns以上的“較長”范圍內(nèi)。該結(jié)果能夠辨別、分離和去除圖像中干擾隨后光電關(guān)聯(lián)流程的信號。

TauScan

可以使用熒光壽命分布來識別和區(qū)分不同熒光壽命的組分，例如樣品中的不同熒光標記。利用TauScan，可以將這些分布掃描并分離成預定數(shù)量的時間窗（圖6）。

數(shù)字預設(shè)門后進行多指數(shù)分量擬合，生成每一個組分到達時間分布的線視圖（圖6，底部）。這種分布使人們能夠以類似于熒光信號光譜分布的方式處理到達時間信息。

該方法能夠獲得信號的時間離散信息，然后根據(jù)光子通量中包含的到達時間信息，設(shè)定適當?shù)臅r間窗口分割光子信號。在區(qū)分信號后，根據(jù)光子的空間編碼可獲得相應的圖像。TauScan實驗獲得的圖像是包含熒光壽命分布中時間離散信息（上文解釋的時間窗口）的強度圖像。

圖6：用TauScan觀察硅藻，獲得樣品的標準強度圖像。使用TauScan技術(shù)，可以檢測到代表2個熒光組分的2個AAT最大值。這里，選擇了10個壽命范圍，得到10組壽命圖像。樣本由德國TU Dresden，B CUBE的Nicole Poulsen提供。

TauSeparation

TauSeparation技術(shù)使用組分的熒光壽命分布，如TauScan所得的分布數(shù)據(jù)，以此分離樣品中的熒光物質(zhì)。用戶借助在線圖表決定最具代表性的平均壽命組分的值。然后TauSeparation選擇合適的時間窗口，在單獨的圖像中顯示該組分（圖7）。這樣，即使是不能通過其光譜性質(zhì)區(qū)分的熒光基團，也可以通過不同的熒光壽命強度圖顏色進行分離和直觀的辨別。因此，該方法可以有效區(qū)分電子顯微鏡的目標結(jié)構(gòu)，增加光電關(guān)聯(lián)工作流程的可靠性。

圖7：用TauSeparation觀察硅藻。樣品的標準強度圖像。通過應用TauScan技術(shù)識別2個組分，結(jié)果顯示可以通過分配不同的顏色來分離圖像中的組分。這些組分分別與葉綠體（藍綠色）和LifeAct-GFP（品紅色）有關(guān)。樣本由德國TU Dresden，B CUBE的Nicole Poulsen提供。

TauGating

除了分離組分，人們還可以去除特定的時間范圍內(nèi)顯示的信息，這樣就可以進一步區(qū)分目標信號和非貢獻信號（圖8）。

對于電子顯微鏡工作流程而言，特別是應用與載網(wǎng)上的低溫電鏡技術(shù)，有時可以觀察到碳層或樣品支撐層的自發(fā)熒光和反射信號。將TauGating技術(shù)應用于相關(guān)通道可清除目標熒光信號，因此增加了下游工藝（如FIB切割）定位精度。

圖8：去除來自碳層的干擾背景信號。萊茵衣藻中兩種不同類型的鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白，IFT-NeonGreen和IFT-mCherry。樣品由德國德累斯頓馬克斯·普朗克分子細胞生物學與遺傳學研究所的Pigino-Lab提供。

完全集成到Coral Cryo軟件工作流程中

LIGHTNING和TauSense這兩種模式都被完全集成到Coral Cryo 工作流程中（圖9）。

圖9：LIGHTNING技術(shù)完全嵌入到Coral Cryo軟件工作流程中。LIGHTNING技術(shù)可應用于每個薄片區(qū)域掃描工作中。因此，該方法可以展示出低溫條件下Cryo CLEM物鏡的完全分辨能力。

對于LIGHTNING技術(shù)而言，軟件提供了一個向?qū)Я鞒?/span>，指導用戶如何根據(jù)需要定義合適的設(shè)置（例如，更高的采集速度與更高分辨率）。這些相互關(guān)聯(lián)的參數(shù)會被自動設(shè)定，以得到預期的高質(zhì)量圖像。

所有TauSense工具都直觀地嵌入到探測器設(shè)置中，可以通過雙擊鼠標激活（圖9）。

圖10：TauSense完全嵌入到Coral Cryo軟件工作流程中。所有TauSense工具在探測器設(shè)置中均可訪問。

總 結(jié)

LIGHTNING和TauSense技術(shù)是幫助用戶提高圖像質(zhì)量和改善圖像數(shù)據(jù)信息內(nèi)容的工具。LIGHTNING技術(shù)增強了在低溫條件下獲得圖像的分辨率，TauSense技術(shù)幫助用戶將目標熒光信號與其他熒光基團甚至不需要的熒光基團（如自發(fā)熒光和/或反射）的信號區(qū)分開。這兩種工具都使用戶能夠進行低溫工作流程，以更可靠和準確地識別冷凍玻璃化樣品內(nèi)的目標結(jié)構(gòu)，特別是對于低溫電子斷層掃描樣品。

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