病理醫(yī)生應(yīng)參與mIF/IHC套餐開發(fā)過程中的每個步驟，從panel設(shè)計(jì)到最終質(zhì)量控制（QC）。病理醫(yī)生需要為組織樣本的生物標(biāo)記物選擇、驗(yàn)證、試驗(yàn)方法、質(zhì)量控制等問題提供科學(xué)和臨床指導(dǎo)。病理醫(yī)生也需要解釋數(shù)據(jù)。任何mIF/IHC成功開發(fā)都取決于病理醫(yī)生、項(xiàng)目技術(shù)人員和免疫科學(xué)家之間的成功合作，經(jīng)常還需要免疫治療藥物廠家的支持。

主要的決定因素應(yīng)該是你們業(yè)務(wù)發(fā)展的需要，尤其是你們醫(yī)院的臨床是否需要，要考慮這項(xiàng)業(yè)務(wù)的開展會給臨床醫(yī)生和患者帶來那些收益。然后可能要考慮的是科學(xué)問題，開展這項(xiàng)業(yè)務(wù)可能會給醫(yī)學(xué)科學(xué)研究帶來那些新發(fā)現(xiàn)。另外，也要考慮樣本可用性。由于mIF/IHC套餐設(shè)計(jì)和驗(yàn)證比傳統(tǒng)的單IHC要求更高，因此只有在傳統(tǒng)的單一IHC分析無法回答我們的科學(xué)研究和解決臨床問題時才應(yīng)使用mIF/IHC套餐。例如，如果所需數(shù)據(jù)僅限于整個切片或區(qū)域?qū)用嫔隙鄠�抗體標(biāo)記的豐度，并且使用多個切片的單一IHC就夠用了。然而，如果所需數(shù)據(jù)要求包括同一細(xì)胞的多個標(biāo)記物的共定位、不同表型的單個細(xì)胞之間的鄰近距離測量及其相對空間分布，mIF/IHC的信息量更大。最后，如果樣品珍貴或難以獲取，也有必要轉(zhuǎn)向開發(fā)mIF/IHC解決方案。

有多種方法可以利用已開發(fā)的單一 IHC來指導(dǎo)多重免疫組化mIF/IHC的開發(fā)。

最簡單的方法是開發(fā)一種傳統(tǒng)單IHC的循環(huán)染色方法，就是依次進(jìn)行抗體染色-全玻片掃描-抗體剝離/去除的循環(huán)，然后融合和對齊每個循環(huán)采集的全切片圖像。但這種方法很耗時耗力，因?yàn)槊總�抗體是串聯(lián)線性加入，而且目前是手動操作。

更好的選擇是選擇一種mIF/IHC染色系統(tǒng)，使用與單IHC相同的一抗，經(jīng)常一抗是未標(biāo)記的。這使得相同的一抗結(jié)合條件（阻斷、濃度、稀釋劑、溫度和時間）可以在做mIF/IHC時重現(xiàn)。如果一抗直接用DNA barcode、半抗原或酶標(biāo)記，則應(yīng)重新確定或至少確認(rèn)結(jié)合條件，因?yàn)橐豢贡桓淖兞�。一旦敏感性和特異性確定沒問題了，一抗應(yīng)用條件應(yīng)保持不變。其他考慮因素包括一抗染色順序、熒光標(biāo)記選擇和其濃度和重復(fù)性測試。盡管有額外的步驟要做，但這是將傳統(tǒng)的單IHC檢測信息應(yīng)用于mIF/IHC套餐的最佳方法。

病理醫(yī)生對熒光的抗拒部分原因是缺乏免疫熒光染色經(jīng)驗(yàn)和缺乏時間學(xué)習(xí)。不幸的是，mIF/IHC的復(fù)雜性在兩方面增加了時間需求。首先，與光學(xué)顯微鏡的傳統(tǒng)識別模式不同，多個生物標(biāo)記物數(shù)據(jù)需要在多個熒光通道之間來回切換。其次，數(shù)字化也有一個習(xí)慣過程，也是病理醫(yī)生面臨的一個挑戰(zhàn)，他們更習(xí)慣于使用手動、普通光學(xué)顯微鏡讀片。病理醫(yī)生在平時的顯色I(xiàn)HC工作中習(xí)慣于將顯色分級為陽性1-3+，但免疫熒光染色具有更大的線性動態(tài)范圍（意味著更精準(zhǔn)的定量分析），病理醫(yī)生往往對此缺乏經(jīng)驗(yàn)。不過，通過適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)、數(shù)據(jù)支持的標(biāo)準(zhǔn)閾值方法以及在病理醫(yī)生中開展這項(xiàng)新技術(shù)好處的教育，病理醫(yī)生可以很快適應(yīng)mIF/IHC。一旦適應(yīng)，與單IHC相比，他們會發(fā)現(xiàn)這項(xiàng)新技術(shù)是幫助他們解決臨床診斷工作的強(qiáng)大工具。此外，許多數(shù)字病理分析程序現(xiàn)在提供了偽彩色選項(xiàng)，可以通過單獨(dú)顯示每個標(biāo)記（或其任何組合，如綠色+紅色信號=黃色信號）來方便新用戶，就像它們在標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字病理（甚至傳統(tǒng)顯微鏡）圖像中出現(xiàn)一樣。

與視野下的感興趣區(qū)域（ROI）相比，病理醫(yī)生應(yīng)用虛擬切片圖像的可視化技術(shù)（WSI）進(jìn)行診斷、分級、評分，病理醫(yī)生基本都此認(rèn)可和滿意，特別是如果能夠生成偽彩單一IHC染色的 WSI（見圖1）。大多數(shù)病理醫(yī)生應(yīng)該能夠通過單獨(dú)顯示每個標(biāo)記物染色或一一組合來手動為mIF/IHC 的WSI評分，就像標(biāo)準(zhǔn)數(shù)字病理學(xué)解決方案一樣。這會是一個很好的過渡或適應(yīng)過程，讓病理醫(yī)生慢慢適應(yīng)熒光染色、尤其是多種熒光染色，并慢慢了解多重染色的好處和強(qiáng)大。

圖1.使用mIF/IHC對正常肝組織的代表性染色圖像，及其仿IHC的偽彩圖像A. mIF/IHC染色：DAPI（藍(lán)色）、CD3（綠色）、泛細(xì)胞角蛋白（紅色）；B．偽彩IHC：DAPI（藍(lán)色），泛細(xì)胞角蛋白（棕色）；C. 偽彩IHC：DAPI（藍(lán)色），CD3（棕色）；D. 偽彩IHC DAPI（藍(lán)色），放大倍數(shù)均為：200倍。

不需要，可以在標(biāo)準(zhǔn)的病理實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。使用暗室是選項(xiàng)而非必須的。

適當(dāng)?shù)慕M織厚度是高質(zhì)量mIF/IHC圖像的關(guān)鍵。適合于mIF/IHC分析的FFPE組織厚度應(yīng)在4–5μm，通常為一個細(xì)胞厚。某些組織類型有不同的切片厚度考慮，例如，大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）組織切片需要8-10μm厚度來顯示神經(jīng)元。另一方面，在組織樣本有限的情況下，如穿刺活檢或淋巴結(jié)，3μm是可以接受的，但小于2μm的厚度有可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。

單一IHC和mIF/IHC的組織處理和切片應(yīng)在相同條件下進(jìn)行。mIF/IHC套餐的優(yōu)化和驗(yàn)證按以下順序進(jìn)行：i）傳統(tǒng)單一IHC；ii）單一IF(單一免疫熒光)；和iii）mIF檢測。這些染色都應(yīng)在連續(xù)的組織切片中進(jìn)行。經(jīng)驗(yàn)表明，將傳統(tǒng)的單一IHC染色轉(zhuǎn)化為mIF染色方案往往都要改變一些東西，例如改變信號檢測系統(tǒng)，從而使單一IHC和mIF/IHC兩種檢測之間獲得相同的信號強(qiáng)度⑵。

每次染色應(yīng)進(jìn)行三個主要對照：

第一個是陽性對照組，它應(yīng)該代表待檢測組織特征。這有助于確定自動染色機(jī)是否正確加樣了所有試劑，還可以在成像后標(biāo)準(zhǔn)化以減少批次效應(yīng)，作為標(biāo)準(zhǔn)化一部分。

第二個是同型或特異性對照。所有一抗應(yīng)替換為非特異性抗體，以顯示染色方法中的非一抗試劑對每個通道中觀察到的信號的貢獻(xiàn)程度。

三是自熒光控制。在不使用任何熒光試劑的情況下揭示組織中的整體自熒光、以及所有試劑的熒光狀態(tài)，這些試劑不應(yīng)該直接影響每個通道中的熒光信號。

mIF/IHC通常不在冷凍樣本上進(jìn)行，因?yàn)榻M織結(jié)構(gòu)在新鮮冷凍組織中的保存不如FFPE樣本。大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小鼠研究除外，這些研究主要在切割8-10μm厚的冷凍組織中進(jìn)行。當(dāng)然，也有在冷凍樣本做mIF/IHC的報道。

骨和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織傾向于顯示高背景染色，這可能會對某些標(biāo)記物的特異性和非特異性染色信號分離形成挑戰(zhàn)。使用較薄的切片、優(yōu)化包被、阻斷步驟和使用單克隆一抗等，可以減少高背景的可能性。使用選擇性抗體稀釋液和包被、封閉試劑可以進(jìn)一步顯著降低背景并增強(qiáng)染色強(qiáng)度。

此外，由于高水平的脂褐素，中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織可呈現(xiàn)較高水平的自體熒光。在蘇丹紅或脂褐素淬滅劑溶液中孵育載玻片有助于緩解這一問題，這些溶液也有助于減少骨髓中的免疫熒光背景染色。自熒光還可以利用多光譜成像和光譜拆解技術(shù)進(jìn)一步解決，允許將自體熒光分離到一個離散通道和每個檢測生物標(biāo)記物通道，而不用考慮熒光強(qiáng)度或光譜重疊，從而提供準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)和定量信息。

雖然組織可以以不同的方式保存，但FFPE是醫(yī)院和研究中心保存臨床樣本的主要方法。病理行業(yè)在福爾馬林固定和對FFPE組織中生物分子降解的理解確實(shí)有爭議。

行業(yè)共識是儲存載玻片在室溫干燥環(huán)境下，組織塊也是在室溫干燥環(huán)境下，將其保存在石蠟塊中（理想情況下，切割表面覆蓋一層石蠟層，以避免組織氧化），并防止光照。保存完好的組織塊可成功保存長達(dá)10年。此后，可能會發(fā)生明顯的組織降解，因此在開始任何有關(guān)mIF/IHC的回顧性研究之前，應(yīng)確認(rèn)10年以上組織塊的形態(tài)質(zhì)量（通過H&E）和其抗原性。

盡管載玻片儲存方案也存在爭議，但共識是使用新切的組織切片，將其4°C儲存在載玻片盒內(nèi)。有些人建議將切好的組織切片存放在干燥的氮?dú)馐抑校ㄒ员苊饨M織氧化），但并非所有實(shí)驗(yàn)室都配備氮?dú)馐�。三個月后，某些標(biāo)記物的抗原表位會喪失，因此，mIF/IHC的最佳實(shí)踐是使用不到三個月的切片。

可行，在mIF/IHC中實(shí)踐中還是傾向于不混用，混合應(yīng)用往往見于下面這種情況：將多個腫瘤/癌癥標(biāo)記物混合到一個通道中，例如，泛細(xì)胞角蛋白（pan-cytokeratin）和任何其他細(xì)胞角蛋白（如肝臟樣本中的CK18），用于確認(rèn)或排除組織的上皮性質(zhì)。

套餐中待檢測標(biāo)志物的數(shù)量取決于技術(shù)平臺和目標(biāo)。臨床應(yīng)用及臨床研究而言，更多并不一定更好。常常，一個包含三個生物標(biāo)志物的套餐就足夠了，例如，泛細(xì)胞角蛋白（pan-cytokeratin）、CD45和PD-L1的三重染色就能滿足對PD-L1表達(dá)的評分⑶。對于一個探索性研究，往往需要更多的生物標(biāo)志物來發(fā)現(xiàn)表達(dá)譜，可以考慮使用具有大規(guī)模能力的多重?zé)晒馊旧�平臺，使用包含較多生物標(biāo)志物的大套餐。

目標(biāo)生物標(biāo)記物的性質(zhì)、可用的抗體以及熒光標(biāo)記是主要決定因素⑷。靶生物標(biāo)記物的表達(dá)模式（核、細(xì)胞質(zhì)或膜）、表達(dá)豐度（少數(shù)至數(shù)百個細(xì)胞）和每個細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，以及在非靶細(xì)胞中的表達(dá)，都是重要的因素。

檢測系統(tǒng)、一抗和二抗以及選擇的熒光標(biāo)記分子對于確定最終結(jié)果的特異性（信噪比）至關(guān)重要。由于最終熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度由其發(fā)射光強(qiáng)度決定的，經(jīng)驗(yàn)是將弱熒光標(biāo)記與豐富或強(qiáng)烈的生物標(biāo)記物相匹配。

其他決定因素包括先前的優(yōu)化過程、正確的抗體和熒光抗體濃度。

原始圖像中的批處理效應(yīng)（設(shè)置優(yōu)化后由掃描儀直接生成的批處理效應(yīng)）由設(shè)置的更改或掃描儀的機(jī)械特性，例如光源、載物臺和校準(zhǔn)、載玻片/蓋玻片厚度和其他變量決定。檢測這些細(xì)微差別和批量效應(yīng)通常需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員或病理醫(yī)生提供線索，他們對QA/QC過程的監(jiān)督對于解決此階段的批處理效果至關(guān)重要，因?yàn)樵�始圖像決定了要生成的下一批圖像（次圖像）。

次圖像通�；�于參考庫和拆解算法生成。由于玻片間的不一致或不正常染色，此類方法可能會出現(xiàn)批錯誤，因此正確的染色是關(guān)鍵�；�于各種熒光標(biāo)記的豐度和分布的染色變化也可能使算法發(fā)生偏差，使其成為批錯誤的潛在來源。畢竟，算法取決于輸入的圖像和參考庫，無論是合成的還是測量的。

類似地，在對算法進(jìn)行訓(xùn)練以執(zhí)行圖像分割和評分之后，在圖像分析期間也可能會出現(xiàn)批處理效應(yīng)問題。這涉及到上述所有要點(diǎn)，及人工智能（AI）準(zhǔn)確分割和評分的能力。因此，批量效應(yīng)必須由訓(xùn)練有素的科學(xué)家和病理醫(yī)生團(tuán)隊(duì)進(jìn)行QA/QC，以確定其影響并避免數(shù)據(jù)報告中出現(xiàn)較大精度錯誤。

可能的，然而，大多數(shù)流式細(xì)胞儀中使用的抗體與IHC（組織中含石蠟）不相容，很可能是因?yàn)榧?xì)胞懸浮液中抗原的表位呈現(xiàn)可能與IHC組織切片中細(xì)胞的抗原的表位或抗原決定簇不同。

在流式細(xì)胞術(shù)中，熒光標(biāo)記通常直接與一抗結(jié)合。相反，大多數(shù)IHC和mIF/IHC方法使用二抗間接標(biāo)記法，因?yàn)橥�往需要二抗進(jìn)行信號放大。流式細(xì)胞儀抗體在流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用中有良好信噪比，但應(yīng)用于mIF/IHC可能是很大的挑戰(zhàn)，因?yàn)閷τ诤�量較低或表達(dá)較弱的蛋白質(zhì)，信號可能較弱或檢測不到。

流式細(xì)胞儀和IHC科學(xué)家對細(xì)胞表型檢測也可能有不同的觀點(diǎn)。例如，IHC科學(xué)家可能只使用FOXP3抗體來鑒定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，而flow科學(xué)家通常還包括譜系標(biāo)記。在將流式細(xì)胞儀的抗體panel轉(zhuǎn)換為mIF/IHC套餐之前，建議進(jìn)行文獻(xiàn)回顧并咨詢免疫學(xué)家和病理學(xué)家。

這取決于檢測目標(biāo)的數(shù)量。通過熒光掃描儀，大部分病理實(shí)驗(yàn)室配備可以輕松實(shí)現(xiàn)四重或四色mIF/IHC。一些熒光掃描儀可以調(diào)整以檢測多達(dá)六個標(biāo)記。對于超過七種顏色的可視化，建議使用多光譜熒光掃描儀，但不是“必備品”。

組織微陣列（TMA）是進(jìn)行mIF/IHC最具成本效益的方法。然而，即使TMA是由病理醫(yī)生構(gòu)建的，經(jīng)過幾次切片后，TMA組織的形態(tài)和成分也會發(fā)生變化。建議在開始mIF/IHC項(xiàng)目之前先進(jìn)行H&E染色，以確保TMA仍然適用。

在資源相對有限的環(huán)境下，mIF/IHC的WSI全切片分析——將是接近實(shí)際病理診斷的理想方式。但是，必須小心區(qū)分“全切片分析”和“全切片檢查”。病理醫(yī)生確實(shí)需要檢查整個切片，但不需要量化整個切片。即使關(guān)注點(diǎn)在腫瘤區(qū)域，生物標(biāo)記物也往往只在熱點(diǎn)區(qū)域計(jì)分或打分。將正確答案——以及正確的科學(xué)問題——置于正確的環(huán)境中是取得成功的關(guān)鍵。

目前基于熒光標(biāo)記的多重?zé)晒饨M織免疫mIF/mIHC是探測腫瘤微環(huán)境應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，TLR專注于mIF/mIHC的相關(guān)技術(shù)，致力于將免疫染色（mIF/mIHC）、熒光圖像采集和分析的自動化和智能化，研發(fā)用于mIF/mIHC的全自動免疫組化染色機(jī)（TR-Stainer） 和熒光全切片掃描儀，其中TR-sWSI-5F熒光掃描儀具備快速5色掃描功能（藍(lán)色DAPI、綠色FITC、黃色TRITC、紅色Cy5、近紅外Cy7），滿足目前免疫熒光組化的絕大多數(shù)臨床需求。而TR-sWSI-MF 的多光譜熒光掃描儀（（定制化））可以將多達(dá)15種顏色和自體熒光彼此得到很好的分離，從而使用戶信心百倍地專注于量化真正發(fā)生的生物學(xué)相互作用，能夠在整個切片上同時觀察和測量組織的細(xì)胞，包括多種細(xì)胞表型。