應(yīng)用紀(jì)要：復(fù)雜融合蛋白O-糖基化表征策略
糖基化是一種常見的蛋白藥物翻譯后修飾（PTM），在抗體關(guān)鍵質(zhì)量屬性中起著重要作用【1】。生物制品中N-和O-糖基化的深度表征對于確保藥物安全性和有效性至關(guān)重要【1】。當(dāng)應(yīng)用于糖肽時(shí)，傳統(tǒng)的基于碰撞的MS/MS方法，如碰撞誘導(dǎo)解離（CID），會(huì)導(dǎo)致不穩(wěn)定聚糖部分的丟失。因此，使用CID精確測定糖基化位點(diǎn)極具挑戰(zhàn)性，尤其是對于沒有共有序列的O-糖基化。與CID相比，電子活化解離（EAD）在糖肽分析方面具有優(yōu)勢，因?yàn)樗軌虮４嫫沃械木厶墙Y(jié)構(gòu)。依那西普是一種二聚體融合蛋白，由兩條腫瘤壞死因子受體（TNFR）-Fc鏈組成，每條鏈上有3個(gè)N-糖基化和13個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，本文將詳細(xì)闡述EAD在糖肽水平上分析O-糖基化信息，采用EAD DDA或MRMHR方法來表征去乙�；滥俏髌盏膹�(fù)雜O-糖基化特征。【2-4】。
SCIEX基于糖基化深度表征方案的特點(diǎn)：
01 EAD 準(zhǔn)確鑒定糖基化位點(diǎn)：不穩(wěn)定聚糖可以保留在EAD碎裂片段中，可準(zhǔn)確鑒定糖基化位點(diǎn)，并可靠區(qū)分O-糖肽的位置異構(gòu)體。
02 卓越的靈敏度和高質(zhì)量的MS/MS數(shù)據(jù)：ZenoTOF 7600系統(tǒng)的Zeno阱可將MS/MS碎片的靈敏度提高5-10倍，從而實(shí)現(xiàn)卓越的MS/MS靈敏度和譜圖質(zhì)量。
03 快速靈活：EAD可在數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）或高分辨定量（MRMHR）模式下運(yùn)行，具有快速掃描速率（DDA模式下約20 Hz）和可調(diào)整電子動(dòng)能（0-25eV）的能力。
04 強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析平臺：Biologics Explorer軟件為肽圖和PTM分析提供了強(qiáng)大、直觀的分析能力。
含1個(gè)O-糖的糖肽
圖1顯示了兩種胰蛋白酶酶切的O-糖肽（L1-R19和T243-K268）的EAD譜圖，它們含有一個(gè)核心聚糖結(jié)構(gòu)（HexNAcHex）。兩個(gè)肽段都含有3個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)（2個(gè)Thr和1個(gè)Ser），但只有一個(gè)位點(diǎn)被HexNAcHex修飾。如圖2所示，EAD產(chǎn)生了質(zhì)量優(yōu)異的MS/MS碎片信息，具有幾乎完整的c/y/z片段序列，可以對這兩種O-糖肽的進(jìn)行可靠鑒定和聚糖的準(zhǔn)確定位。具體而言，基于c7/c9和y11/z12片段的m/z，肽段L1-R19（圖1A）中的O-糖基化位點(diǎn)被確定為T8，而基于檢測到非糖基化c2/y23片段和包含糖基化的c3/y24/z24片段，肽段T243-268（圖1B）中的T245被HexNAcHex修飾。
含多個(gè)O-糖的糖肽
依那西普的胰蛋白酶酶切產(chǎn)生的長肽段（S202-K238），其包含11個(gè)潛在的O-糖基化位點(diǎn)（6個(gè)Ser和5個(gè)Thr），EAD數(shù)據(jù)證實(shí)11個(gè)位點(diǎn)中有7個(gè)被O-糖占據(jù)。圖2顯示了含有6或7個(gè)HexNAcHex的EAD MS/MS譜圖。多個(gè)脯氨酸殘基（總共9個(gè)）的存在阻止了對應(yīng)于脯氨酸N端裂解的c/z片段的產(chǎn)生。通過在KE=7eV時(shí)檢測額外的a/y片段，部分克服了這一限制。通過考慮所有碎片離子（c/z/a/y），可以確定序列中6或7個(gè)HexNAcHex的位置（圖2）。
我們觀察到糖肽S202-K238的兩種位置異構(gòu)體，其含有6個(gè)HexNAcHex部分。圖3顯示了特征EAD片段，即用于區(qū)分這兩種異構(gòu)體的雙電荷c11、c12和c15。從兩種異構(gòu)體的EAD產(chǎn)生的c12的m/z差異（365 Da）表明，T213（序列中的T12）在異構(gòu)體1中被O-糖基化（圖3B），但在異構(gòu)體2中沒有（圖3E）。兩種異構(gòu)體的c15的m/z相同的事實(shí)表明，S216（序列中的S16）在異構(gòu)體2中被HexNAcHex修飾（圖3F），但在異構(gòu)體1中未被糖基化（圖3C）。這些結(jié)果證明了EAD在正確區(qū)分位置異構(gòu)體方面的能力，這對傳統(tǒng)的基于碰撞的MS/MS方法（如CID）是無法完成的。
■ 總結(jié)
1. 準(zhǔn)確鑒定和精準(zhǔn)定位依那西普的O糖基化信息。
2. 高質(zhì)量EAD數(shù)據(jù)能夠定位含有多達(dá)7個(gè)O糖位點(diǎn)的O-糖肽。
3. O-糖肽的位置異構(gòu)體基于EAD中產(chǎn)生的完整或接近完整的序列離子系列進(jìn)行明確區(qū)分。
4. EAD方法可用于闡明蛋白藥物治療中的復(fù)雜糖基化譜圖信息。
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References
1. Zhang P et al. (2016) Challenges of glycosylation analysis and control: an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs. Drug Discovery Today 21(5): 740-765.
2. A new electron activated dissociation (EAD) approach for comprehensive glycopeptide analysis of therapeutic proteins. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-12980-A.
3. Comprehensive glycopeptide analysis of a protein-based vaccine. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13816-A.
4. Site-specific N-linked glycan profiling on the fusion protein aflibercept using a novel fragmentation technique. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-14145-A.
發(fā)布者：SCIEX
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