新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），簡(jiǎn)稱“新冠肺炎”，已在全世界范圍造成巨大的危害，導(dǎo)致數(shù)百萬人失去生命，對(duì)人們的工作和生活造成巨大的影響。其特點(diǎn)是缺氧，迅速惡化，并伴有發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、多器官衰竭甚至死亡的風(fēng)險(xiǎn)。由于未能完全了解發(fā)病機(jī)制和患者間異質(zhì)性，限制了以biomarker為導(dǎo)向的靶向精確醫(yī)學(xué)方法研究。本文中，研究者利用多組學(xué)研究思路，解析新冠肺炎患者血液特征，構(gòu)建了多組學(xué)分子圖譜，并與膿毒癥和流感患者進(jìn)行比較，為個(gè)性化藥物治療方法的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

文章詳情    

文章題目：A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks of diseaseseverity and specificity

中文題目：新冠肺炎的血液圖譜定義了疾病嚴(yán)重程度和特異性的特征

發(fā)表時(shí)間：2022.03

期刊名稱：Cell

影響因子：41.582

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：10x Genomics 單細(xì)胞測(cè)序多組學(xué)+Tims-TOF 4D蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)等技術(shù)

DOI：10.1016/j.cell.2022.01.012

研究?jī)?nèi)容    

·  新冠肺炎的臨床特征、嚴(yán)重程度和疾病分級(jí)

研究者首先使用質(zhì)譜流式和CITE-seq技術(shù)，以單細(xì)胞分辨率在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上解析PBMC的類型、亞型和類群（圖1A-C）。結(jié)果表明，在更嚴(yán)重或危重的病例中中性粒細(xì)胞的絕對(duì)和相對(duì)豐度增加，而T、B淋巴細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、嗜堿性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞減少（圖1D）。在社區(qū)型和康復(fù)的新冠患者中，細(xì)胞組成與健康志愿者大致相似，豐度上存在一些差異。中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、漿母細(xì)胞和PDC的頻率是影響患者組間細(xì)胞組成的重要因素。單獨(dú)分析住院的新冠肺炎病例時(shí)，最大的變異成分（PC1）與組成員、氧合狀態(tài)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)（圖1F），更高豐度的血小板/CD34-巨核系祖細(xì)胞和循環(huán)cMono與氧合狀態(tài)、嚴(yán)重程度和CRP有關(guān)。血小板/CD34-巨核系祖細(xì)胞豐度也與血栓栓塞的發(fā)生有關(guān)（圖1H），強(qiáng)調(diào)了它們?cè)趪?yán)重新冠肺炎中潛在的病理生理學(xué)意義。

Fig.1 單細(xì)胞成分分析揭示了不同臨床組和嚴(yán)重程度的細(xì)胞群差異

·  新冠肺炎全血特征和嚴(yán)重程度涉及中性粒細(xì)胞、祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞耗竭、凝血、免疫球蛋白和干擾素反應(yīng)

接下來，研究者使用全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)θ�血進(jìn)行解析，以獲得宿主對(duì)新冠肺炎反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組特征，并發(fā)現(xiàn)在不同組間的樣品存在明顯的分離（圖2A）。在住院的新冠患者中，最大的方差分量與28天死亡率相關(guān)（PC1）（圖2B），與這個(gè)成分有關(guān)的基因富集于免疫系統(tǒng)功能（尤其是中性粒細(xì)胞脫粒）、PD-1信號(hào)、抗菌肽和凝血級(jí)聯(lián)。而在不同嚴(yán)重程度患者中差異表達(dá)的基因主要富集在TCR和PD-1信號(hào)、抗菌肽、顯微蛋白凝塊形成、整合素和免疫調(diào)節(jié)相互作用以及血小板和中性粒細(xì)胞脫粒（圖2C和2D）。與膿毒癥相比，新冠肺炎的特點(diǎn)包括許多免疫球蛋白heavy/kappa/lambda基因的上調(diào)和與細(xì)胞增殖、先天/獲得性免疫功能相關(guān)的獨(dú)特通路富集。隨后，研究者使用WGCNA分析確定了與新冠肺炎嚴(yán)重程度高度相關(guān)的基因模塊。MEGrey60模塊在危重癥新冠肺炎中的表達(dá)高于膿毒癥，并且ERG基因顯示出最高的模塊內(nèi)連接（connectivity）（圖2F）。這些結(jié)果說明這個(gè)模塊代表了與嚴(yán)重程度相關(guān)的多種祖細(xì)胞，進(jìn)一步支持了這些細(xì)胞的重要性。全血中存在不成熟中性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞前體細(xì)胞，在新冠患者中，中性粒細(xì)胞CD49d的表達(dá)上升，CD43降低，但在膿毒癥患者中基本沒有變化，CD49d/CD43比值在恢復(fù)期保持較高水平（圖2G）。

Fig.2 新冠肺炎的轉(zhuǎn)錄組特征

·  新冠肺炎共享和細(xì)胞類型特異性的單細(xì)胞基因表達(dá)特征涉及ZFN、核糖體和細(xì)胞周期基因、AP-1和干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

在住院和社區(qū)型新冠患者中，研究者發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)的差異主要涉及cMono、幼稚B細(xì)胞、漿母細(xì)胞、CD4⁺T細(xì)胞和循環(huán)NK細(xì)胞（圖2H）。再次使用WGCNA確定主要細(xì)胞亞群的網(wǎng)絡(luò)模塊，在細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)了一組 I 型 IFN 反應(yīng)模塊，其中具有代表性的基因表達(dá)譜（模塊特征基因）與較輕的疾病、更好的氧合狀態(tài)和從癥狀發(fā)作開始的早期采樣相關(guān)。第二個(gè)模塊基因富集于AP-1和p38MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)基因，第三個(gè)模塊富含經(jīng)典 (C2H2) 鋅指 (ZNF) 基因，包含 IRF2 和 IL16，第四個(gè)模塊涉及核糖體蛋白和炎癥小體功能，與單核細(xì)胞COVID-19嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。最后，研究者發(fā)現(xiàn)了一組“周期”模塊，在cMono中與嚴(yán)重程度有關(guān)。此外，還鑒定到了CD4⁺ T細(xì)胞中JAK-STAT/白細(xì)胞介素信號(hào)模塊，以及 cMono 中的 EGFR 通路富集模塊（圖3A-H）。

Fig.3 單細(xì)胞基因表達(dá)模塊鑒定新冠肺炎反應(yīng)的特征

·  單核細(xì)胞群嚴(yán)重程度的轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳學(xué)特征

對(duì)特異性單核吞噬細(xì)胞群進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)病情程度較重的住院新冠患者cMono比例相對(duì)更高，而中間單核細(xì)胞、ncMono和DC更低。隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，發(fā)現(xiàn)cMono的表型轉(zhuǎn)變?yōu)檩^低的HLA-DR、CD33和CD11c的表達(dá)，存在增殖性單核細(xì)胞，這與膿毒癥患者的變化類似。與重癥/危重新冠肺炎患者相比，膿毒癥pDC和CD33^lowcDC2水平較低（圖4A-C）。與健康志愿者相比，新冠肺炎危重病例、流感和膿毒癥患者中的周期類群和抗氧化性金屬硫蛋白基因高表達(dá)的類群顯著增加。利用單細(xì)胞ATAC seq分析染色質(zhì)的可及性，發(fā)現(xiàn)可及性差異最大的染色質(zhì)峰相關(guān)基因包括STK24和FGFRL1。DNA結(jié)合motifs最顯著富集于AP-1、SW1/SNF和Bach轉(zhuǎn)錄因子家族成員（圖4E）。與健康志愿者相比，新冠肺炎患者髓樣細(xì)胞中包含F(xiàn)OS和JUN motifs的基因組區(qū)域可及性更高，這一信號(hào)在恢復(fù)期也可以看到（圖4F）。

Fig.4 髓樣細(xì)胞和淋巴細(xì)胞亞群的變化與新冠肺炎嚴(yán)重程度有關(guān)

·  新冠肺炎的嚴(yán)重程度與特異的T和NK細(xì)胞群以及與細(xì)胞周期、氧化還原狀態(tài)和衰竭相關(guān)的特征相關(guān)

在所有新冠肺炎患者組中，活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞的頻率都有所增加，并在恢復(fù)期保持高水平。CD27⁺的活化CD4⁺T細(xì)胞比例高于膿毒癥患者，而CD56⁺細(xì)胞毒性CD8⁺T細(xì)胞比例降低（圖4A）。雖然在急性新冠肺炎患者中活化的CD4⁺T細(xì)胞中有激活、增殖和耗竭marker的表達(dá)，但隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，CD8⁺T細(xì)胞中這些marker增加（圖4G）。隨著新冠肺炎嚴(yán)重程度的增加，類先天淋巴細(xì)胞群發(fā)生變化，包括MAIT細(xì)胞，表現(xiàn)出一種涉及細(xì)胞激活嚴(yán)重程度的變化梯度（圖4H）。

·  重癥新冠肺炎與未突變B細(xì)胞的克隆性增殖和自身反應(yīng)性B細(xì)胞的激活有關(guān)

接下來，研究者利用bulk VDJ測(cè)序來研究全血中B細(xì)胞的免疫組庫。在健康志愿者中，克隆性擴(kuò)張?jiān)谟洃汢細(xì)胞群體中占主導(dǎo)地位。而在新冠肺炎和膿毒癥患者中，漿母細(xì)胞擴(kuò)張，嚴(yán)重和顯著危重的新冠肺炎患者也在記憶群體中存在克隆。漿母細(xì)胞的克隆性擴(kuò)張具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且與新冠肺炎嚴(yán)重程度相關(guān)，而膿毒癥則沒有顯著變化（圖5B）。新冠肺炎患者幼稚B細(xì)胞和漿母細(xì)胞之間存在分化方向，與膿毒癥患者不同，并與新冠肺炎以濾泡外B細(xì)胞為主的反應(yīng)一致（圖5D）。接下來，研究者測(cè)試了靶向自身抗原和紅細(xì)胞抗原的B細(xì)胞是否與新冠肺炎有關(guān)，發(fā)現(xiàn)自身反應(yīng)性IGHV4-34BCR在IGHD/M中顯著耗盡，但在類轉(zhuǎn)換B細(xì)胞中升高，最顯著的是IGHA2和IGHG2 B細(xì)胞（圖5E），與這些自身反應(yīng)性B細(xì)胞在對(duì)SARS-CoV-2的反應(yīng)中的類別轉(zhuǎn)換一致。在膿毒癥病例中，沒有觀察到IGHV4-34自身反應(yīng)性BCR水平或類別轉(zhuǎn)換的明顯差異。上述結(jié)果表明，重癥新冠肺炎患者的漿母細(xì)胞擴(kuò)張包括高水平的廣泛自身反應(yīng)性B細(xì)胞，這與B細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的免疫病理的新作用相一致。

Fig.5 B和T細(xì)胞免疫組庫的差異與新冠肺炎嚴(yán)重程度相關(guān)

· CD8⁺T細(xì)胞群體免疫組庫多樣性降低

研究者分析新冠肺炎和T細(xì)胞克隆性之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)在考慮年齡的情況下，重癥和危重新冠肺炎患者中CD8⁺T 效應(yīng)記憶、CD8⁺ T中央記憶和 MAIT 細(xì)胞多樣性降低，膿毒癥也有類似的變化。在住院患者中，隨著疾病嚴(yán)重程度的增加，含有TCR的CD8⁺T效應(yīng)記憶細(xì)胞的比例較低（圖5J）。危重患者的SARS-CoV-2反應(yīng)性細(xì)胞未能擴(kuò)張為效應(yīng)表型，或者擴(kuò)張的細(xì)胞可能有明顯的重新分布。CD8⁺T效應(yīng)記憶細(xì)胞在危重疾病中的新冠肺炎克隆型相對(duì)耗竭（圖5M）。

· 新冠肺炎血漿蛋白質(zhì)組揭示嚴(yán)重程度和疾病特異性的相關(guān)性涉及急性期蛋白、代謝過程和組織損傷的標(biāo)志物低

作為對(duì)多組學(xué)研究的補(bǔ)充，研究者使用LC-MS/MS 技術(shù)研究血漿蛋白組特征，并發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重程度和病因的差異。嚴(yán)重疾病與急性期蛋白、補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白、補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合體成分和與功能相關(guān)的蛋白質(zhì)家族上調(diào)有關(guān)（圖6A和B）。通過蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)大類群，富集于包含膽固醇運(yùn)輸和纖維蛋白血栓的生物學(xué)過程。兩個(gè)較小的富集于細(xì)胞溶解和補(bǔ)體激活的類群與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（圖6C）。與樣品間差異主要相關(guān)的過程有急性期反應(yīng)和炎癥、代謝和膽固醇運(yùn)輸。輕度住院的新冠肺炎患者在類維生素A、膽固醇、脂蛋白和脂溶維生素的囊泡運(yùn)輸和代謝過程上與健康志愿者不同；而社區(qū)患者的補(bǔ)體激活和凝血水平更高。將重癥和膿毒癥患者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)了19個(gè)蛋白顯示出新冠肺炎特有的變化，表現(xiàn)為急性期反應(yīng)增強(qiáng)、補(bǔ)體活化和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。

· 血漿細(xì)胞因子和趨化因子圖譜顯示炎癥介質(zhì)參與的證據(jù)

為了表征SARS-CoV-2應(yīng)答的炎癥介質(zhì)，研究者使用Luminex分析了51個(gè)循環(huán)細(xì)胞因子和趨化因子蛋白。結(jié)果表明，與健康志愿者相比，49%新冠肺炎患者的血漿中分析物含量豐度不同，其中其中CCL2、CCL19等上調(diào)表達(dá)的因子與住院新冠肺炎患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)（圖6D）。進(jìn)一步與膿毒癥和流感進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)重癥/危重新冠肺炎患者血漿G-CSF、IL-8、TNF等蛋白水平水平低于膿毒癥（圖6E）。使用蛋白質(zhì)—臨床特征分析解析新冠肺炎嚴(yán)重程度發(fā)現(xiàn)臨床特征與GM-CSF、CXCL10和TREM-1等蛋白質(zhì)存在強(qiáng)烈相關(guān)性（圖6F）。

Fig.6 新冠肺炎的血漿蛋白質(zhì)特征及其亞表型

· 血漿蛋白質(zhì)組變異鑒定不同疾病嚴(yán)重程度的患者亞型

利用SNF整合LC-MS/MS 和 Luminex數(shù)據(jù)，通過對(duì)疾病嚴(yán)重程度分析（吸入氧濃度和SOFA氧氣評(píng)分）發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)分離的類群，并鑒定到11個(gè)蛋白質(zhì)作為分類的主要判別特征（圖6G）。當(dāng)比較這兩個(gè)類群時(shí)發(fā)現(xiàn)類群2與較高的28天死亡率相關(guān)（圖6H）。在另一個(gè)利用Olink蛋白檢測(cè)技術(shù)的隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，利用11個(gè)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中的7個(gè)確定了2個(gè)最佳類群，這些與疾病嚴(yán)重程度有明確關(guān)系（圖6I），區(qū)分新冠肺炎和膿毒癥的特征包括在膿毒癥中升高的LCN2和CCL20，以及在新冠肺炎中升高的CXCL10、APCs和FN1。

· 有監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)鑒定預(yù)測(cè)疾病嚴(yán)重程度的蛋白質(zhì)biomarkers

使用機(jī)器學(xué)習(xí)將兩種蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和全血全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序整合分析，確定了實(shí)驗(yàn)類型特異性的方差信息成分，以降低訓(xùn)練樣品集的維度，然后確定哪些信息最豐富，哪些基因/蛋白質(zhì)對(duì)每個(gè)成分的貢獻(xiàn)最大（圖7A）。分析結(jié)果表明，急性期蛋白SAA2和CRP、IGHG4、趨化因子(CCL20和CCL2)、IL-6和補(bǔ)體成分C5a可預(yù)測(cè)嚴(yán)重程度，在hold-out驗(yàn)證集中驗(yàn)證這些特征的綜合表現(xiàn)，預(yù)測(cè)WHO類別組的平衡準(zhǔn)確率為75%-80%（圖7B）。此外，還在住院新冠肺炎患者和膿毒癥患者中篩選特征，結(jié)果鑒定到81個(gè)特征，確定了特異的差異表達(dá)基因、蛋白質(zhì)和顯著富集的一些通路包括造血細(xì)胞譜系和腎素-血管緊張素系統(tǒng)。

· 新冠肺炎嚴(yán)重性和特異性的綜合標(biāo)志

利用SDA算法，從細(xì)胞組成、基因表達(dá)和血漿蛋白質(zhì)組學(xué)角度入手，對(duì)152個(gè)樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了381個(gè)潛在的SDA成分（圖7C和D）。其中成分171與新冠肺炎嚴(yán)重程度最相關(guān)，該成分的高特征貢獻(xiàn)來自血漿蛋白質(zhì)，包括升高的血漿趨化因子（趨化和激活、GM-SCF以及急性期激活蛋白、LRG1和LBP）、豐度降低的中間單核細(xì)胞、高表達(dá)的細(xì)胞應(yīng)激伴侶CLU和甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL7B、下調(diào)表達(dá)的IgE受體和多個(gè)HLA II類基因，以及抗原呈遞、TCR 信號(hào)傳導(dǎo)和哮喘的通路富集（圖7E）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)于健康志愿者相比，有130個(gè)SDA成分與新冠肺炎有關(guān)。與輕、重度但非危重疾病相關(guān)的成分包括成分256(干擾素反應(yīng)基因上調(diào)，過氧化氫酶和細(xì)胞色素c氧化酶等基因下調(diào)，該成分是新冠肺炎患者特有的）和成分42（圖7F）。這種方法還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)新冠肺炎特有的成分187，它在住院和社區(qū)新冠肺炎患者中的NK、B和T細(xì)胞中具有高負(fù)荷分?jǐn)?shù)（圖7G）。此外，研究者還鑒定到新冠肺炎和流感相關(guān)的成分，包括廣泛上調(diào)的免疫球蛋白heavy/kappa/lambda基因、JCHAIN、與可能的抗體依賴的細(xì)胞毒性有關(guān)的MZB1(成分6)；以及顯著上調(diào)干擾素途徑基因(成分235)。（圖7H和I）�？傮w而言，潛在成分分析確定了關(guān)于膿毒癥和流感的新冠肺炎嚴(yán)重程度和特異性的特征。研究者發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵的細(xì)胞群體如增殖的單核細(xì)胞和漿母細(xì)胞，以及從干擾素信號(hào)到骨髓生成、免疫球蛋白產(chǎn)生和應(yīng)激激活反應(yīng)信號(hào)的固有和適應(yīng)性機(jī)制的特征。

Fig.7 綜合性方法分析定義新冠肺炎反應(yīng)的標(biāo)志

主要結(jié)論  

本研究構(gòu)建了一個(gè)關(guān)于不同新冠肺炎疾病程度的綜合型多組學(xué)血液圖譜，并與流感、膿毒癥患者和健康志愿者進(jìn)行比較，鑒定到免疫特征和宿主反應(yīng)的相關(guān)因素。疾病嚴(yán)重程度的特征涉及細(xì)胞、它們的炎癥介質(zhì)和網(wǎng)絡(luò)，包括祖細(xì)胞和特定的髓樣和淋巴細(xì)胞亞群，免疫組庫的特征，急性期反應(yīng)，代謝和凝血。持續(xù)的免疫激活涉及AP-1/p38MAPK，這是新冠肺炎的一個(gè)特征。血漿蛋白質(zhì)組能夠?qū)�患者群進(jìn)行亞表型分型，并能預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度和預(yù)后�；�于系統(tǒng)的綜合分析顯示，與流感和膿毒癥相比，特征分組與嚴(yán)重性和特異性有關(guān)。綜上所述，研究者使用的方法和構(gòu)建的血液圖譜將有助于未來的藥物開發(fā)、臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和新冠肺炎的個(gè)性化用藥方法。

參考文獻(xiàn)

A blood atlas of COVID-19 defines hallmarks ofdisease severity and specificity. Cell vol. 185,5 (2022): 916-938.e58. .