寫在開頭：

2020，相信大家也和小編一樣，在家宅了很久很久，長時間的隔離在家不出門，網絡上鋪天蓋地的疫情信息，讓不少人感到了迷茫、緊張、不安，甚至有了那么一絲絲恐慌，這些大都是正常的應激反應。如果感覺自己受到了過多的負面消息的影響，請將注意力適當的抽回來，專注與自己的生活和感受，避免被負面情緒壓垮，出現心理應激表現。

在此，我們也為大家解讀一篇最新發(fā)表在“Neuron”上的研究論文，去了解一下大麻激活的大腦受體與焦慮和壓力之間的聯(lián)系，從分子水平的藥理學治療，調節(jié)與壓力相關的焦慮和抑郁癥狀。

摘要

杏仁核和背內側前額葉皮層(dmPFC)之間的功能耦合與消極情感狀態(tài)的產生有關；然而，壓力增加杏仁核- dmPFC突觸強度并產生焦慮樣行為的機制尚不清楚。范德比爾特大學醫(yī)學中心（Vanderbilt University Medical Center）的研究人員結合Inscopix在體超微顯微成像技術和動物行為學實驗相結合，發(fā)現大麻激活的大腦受體可以作為減少壓力的靶點，激活受體的分子可以較少兩個腦域之間的焦慮關聯(lián)，進而保護個體免受壓力侵害。這項研究近期發(fā)表在Neuron上，“Endocannabinoid Signaling Collapse Mediates Stress-Induced Amygdalo-Cortical Strengthening”。

研究人員證明了小鼠基底外側杏仁核(BLA)-邊緣前前額葉皮層(plPFC)回路是通過應激和激活這一途徑在抗焦慮中發(fā)揮作用的。此外，他們還證明了急性壓力暴露會導致在相互的BLA-plPFC-BLA亞回路中突觸強度的持續(xù)增加。重要的是，發(fā)現2-花生四烯酸甘油酯(2-AG)介導的內源性大麻素信號是限制BLA-plPFC突觸谷氨酸釋放的關鍵機制，而多模態(tài)2-AG信號的功能崩潰則是導致應激暴露后持續(xù)的電路特異性突觸強化和焦慮樣行為的分子機制。這些數據表明，2-AG信號通路的電路特異性損傷可能促進BLA和plPFC之間的功能耦合，以及環(huán)境應激向情感性病理的轉化。

正文

壓力暴露是導致嚴重抑郁、焦慮和物質使用障礙等精神疾病發(fā)展和惡化的主要危險因素。此外，嚴重的壓力會最終發(fā)展為創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)。在此背景下，了解壓力暴露轉化為獨特的病理行為、情緒和認知領域的分子、細胞和環(huán)路水平的機制可能具有廣泛的臨床意義。此外，闡明壓力與情感性精神病理之間的分子機制可以揭示減輕壓力對精神健康不良影響的新治療方法。盡管許多壓力調節(jié)神經調控信號系統(tǒng)的識別已經揭示了情感性疾病潛在的新的治療靶點，內源性大麻素(eCB)信號系統(tǒng)是一個主要的藥物開發(fā)候選代表。

eCB信號系統(tǒng)與應激反應生理學密切相關，而eCB信號的藥理增強被認為是一種治療應激和創(chuàng)傷相關精神疾病的新方法。在突觸水平，2-花生四烯基甘油(2-AG)介導的eCB信號是一個廣泛表達的抑制性逆行信號系統(tǒng)。具體地說，2-AG是由突觸后神經元通過二酰甘油-脂肪酶(DAGLa)以活動依賴的方式產生，并激活突觸前CB1受體，降低神經遞質釋放的概率。2-AG被單酰甘油脂肪酶(MAGL)在突觸前末端和膠質細胞中表達降解。最近的研究表明2-AG信號是一種關鍵的應激調節(jié)系統(tǒng)，2-AG增強是一種治療應激相關精神疾病的新方法。例如，2-AG的缺乏與焦慮增加、恐懼消退受損以及對應激性焦慮的易感性增加有關。相反地，2-AG的增加可以提高壓力恢復力，防止壓力引起的焦慮。盡管有這些數據，2-AG與環(huán)境壓力相互作用從而影響情緒行為的精確的細胞和環(huán)路水平的機制還沒有被很好地理解。

過去十年的研究已經闡明了在調節(jié)壓力反應、焦慮和情緒調節(jié)方面連接情緒和認知控制中心的不同的大腦環(huán)路。例如，在人類中，當暴露于威脅刺激時，背內側前額葉皮層(dmPFC)和杏仁核表現出興奮性耦合，杏仁核-dmPFC環(huán)路的增強活動與焦慮的主觀評級相關。與這些發(fā)現一致的是，嚙齒類動物基底外側杏仁核(BLA)激活前邊緣前額葉皮層 (plPFC)(與人類dmPFC相似的嚙齒類動物)的輸入，會產生焦慮樣行為，并在面對不確定性時對恐懼反應產生偏見行為。最近的研究也表明，BLA-plPFC的谷氨酸能突觸在應激暴露后發(fā)生突觸前強化。綜上所述，這些數據表明，增強的杏仁核- dmpfc(嚙齒動物中的BLA-plPFC)耦合可能代表了一種將壓力暴露轉化為焦慮樣情緒狀態(tài)的保守環(huán)路機制。然而，其分子機制有助于應力誘導的BLA-plPFC回路的增強和應激暴露后焦慮樣行為的產生尚不清楚。在這里，研究人員闡明了一個eCB機制，將壓力暴露與BLA-plPFC亞環(huán)路特異性突觸強化和持續(xù)性焦慮樣行為聯(lián)系起來。

結果

1.     BLA-plPFC電路具有應激反應性和抗焦慮性

為了研究調節(jié)BLA-plPFC連通性和可塑性的分子機制，研究人員首先驗證了該環(huán)路是通過暴露于壓力而參與的(圖1A)。利用在體光纖光度法，研究人員觀察到，不可預測的足底電擊應激顯著增加了激活plPFC的BLA軸突終末突觸前Ca2+內流，并對休克開始起定時鎖定作用(圖1B和1C)。接下來，研究人員使用Inscopix在體超微顯微成像技術對體內單細胞Ca2+成像來檢測plPFC神經元對足底電擊的反應。整個視野內神經元的Ca2+信號隨電擊暴露而增加(圖1D和1E)，隨后的單細胞分析顯示了三種不同的神經元種群：應激興奮性(44.40%)、應激抑制性(38.43%)和應激無反應性(17.16%)(圖1F和1G)。(興奮性:|z| = 3.83，抑制性:|z| = 2.62，雙尾t檢驗p = 0.0073)，合成平均信號為興奮性(z = 1.09;圖1H)，提示應激誘導的plPFC神經元興奮多于抑制。這些數據表明，壓力暴露參與了BLA-plPFC環(huán)路，并導致了plPFC神經元活性的增強。

壓力暴露是焦慮障礙發(fā)展的普遍危險因素，嚙齒動物的壓力暴露可以模擬許多與情感性障礙相關的精神病理領域。事實上，在足底電擊應激暴露24小時后，研究人員觀察到在高架零迷宮(EZM)中焦慮樣行為的增加(圖1I)。為了測試是否可以通過直接激活BLA-plPFC環(huán)路來再現“應激樣”狀態(tài)，研究人員使用了一種交叉的化學發(fā)生方法來具體增強投射到plPFC的BLA神經元的興奮性(圖1J)。研究人員使用全細胞電流鉗電生理學方法研究了氯氮平氮氧化物(CNO)應用后，plPFC投射的BLA錐體神經元表達的hM3D設計受體被設計藥物(GqDREADD)激發(fā)的興奮性動作電位(APs)特異性激活(圖1K)。在BLA(圖1L)和mPFC(圖1M)中，給予CNO也可誘導cFOS的穩(wěn)健表達。此外，盡管應激導致plPFC神經元的激活(圖1 d和1 e)，但在GqDREADD激活BLA-plPFC神經環(huán)路后，應激沒有導致cFOS在BLA(n = 6，p = 0.6418)或plPFC (n = 6，p = 0.0855)的表達的進一步增加，表明應激和GqDREADD激活補充了重疊BLA-plPFC神經環(huán)路。在高架十字迷宮(EPM)中，該環(huán)路的化學發(fā)生激活顯著增強了焦慮樣行為(圖1N)。這些數據表明，在小鼠中，BLA-plPFC回路是應激響應的，其激活是焦慮源性的，提示應激誘導的焦慮樣行為可以通過增強BLA-plPFC環(huán)路功能來介導。

圖1 壓力暴露會激活焦慮性的BLA-plPFC回路

2.     應激暴露增強了BLA-plPFC互反電路中的興奮性信號

數據表明，增強的BLA-plPFC環(huán)路活性可能是環(huán)境壓力轉化為焦慮樣行為的相關底物。為了研究在BLA-plPFC電路中受到壓力誘導的突觸適應性，使用了順行chr2輔助投射靶向、逆行追蹤方法和體外電生理學相結合的方法(圖2A和2B)。將順行性腺相關病毒aav5 - camki -ChR2- eyfp (ChR2)與逆行性AAV2-CAG-td-Tomato (rAAV)共注射入BLA后4 ~ 6周，處死小鼠進行體外電生理研究。

足底電擊后24小時，研究人員觀察到，rAAV+ L2/3 plPFC神經元中，BLA源性oEPSC振幅增加，配對脈沖比(PPR)下降(圖2C-2E)，應激后，在一個互反的BLA-plPFC-BLA子環(huán)路中，谷氨酸釋放概率增加。這種增強的興奮性驅動伴隨著rAAV+ L2/3神經元突觸驅動的動作電位放電概率的增加和這些神經元固有的興奮性的少量但顯著的增加(圖2F和2G)。

研究人員還觀察到，在L2/3rAAV+神經元上，光遺傳誘導的異步EPSCs(o-aEPSCs)的頻率增加，但幅度沒有增加，證實了應激暴露后24小時BLA-plPFC突觸的突觸前釋放概率增加(圖2H)。相反，L2/3rAAV神經元的興奮性輸入(圖2J)、PPR(圖2K)或軀體驅動AP放電(圖2L)在應激后沒有明顯變化。在L2/3 rAAV中觀察到的唯一變化是神經元光基因誘發(fā)的動作電位放電明顯減少(圖2M)。

3.     內源性大麻素信號廣泛地抑制從BLA到plPFC的谷氨酸能輸入

鑒于觀察到的應激誘導的BLA-plPFC谷氨酸能傳遞的增加是由增強的突觸前釋放介導的，研究人員接下來試圖確定這種效應的驅動機制。眾所周知，逆行作用的ECBs，即anandamide(AEA)和2-AG，受到應激的調節(jié)，并調節(jié)PFC中的突觸傳遞，這增加了這個神經調制系統(tǒng)中的功能損傷可能有助于應激暴露后BLA-plPFC突觸突觸前驅動增加的可能性。為了驗證這一假設，研究人員首先證明了大麻素受體激動劑cp55，940在rAAV+和rAAV中強烈地抑制了血乳酸誘發(fā)的oEPSC振幅。L2/3plPFC神經元，表明BLA投射到plPFC受到大麻素受體的廣泛調節(jié)(圖3A、3B、3E和3F)。為了確定ECBs是否調節(jié)BLA-plPFC谷氨酸能傳遞，研究人員分析了去極化誘導的興奮抑制(DSE)，這是一種典型的2-AG介導的短期突觸抑制，突觸后短暫的去極化導致2-AG的產生，并通過與突觸前CB1受體結合抑制谷氨酸的釋放。研究人員發(fā)現，突觸后10s去極化至+30 mV誘導的DSE在L2/3rAAV+和rAAV上均有表達。CB1反向激動劑利莫那班或DO34是2-AG生物合成限速酶(DAGL)的抑制劑(圖3C和3G)。有趣的是，這兩個化合物單獨誘導了PPR的顯著降低，表明2-AG-CB1信號可以緊張性地抑制BLA-plPFC突觸的谷氨酸釋放(圖3D和3H)。為了確保利莫那班對PPR的影響是由于阻斷緊張性ECB信號而不是其反向激動劑特性，研究人員用中性CB1拮抗劑NESS0327(Ness)重復了這一實驗。Ness和利莫那班都阻斷DSE，降低PPR，并導致更大的oEPSC振幅，進一步支持ECB對BLA-plPFC谷氨酸能突觸的緊張性控制。鑒于強直的ECB信號通常被歸因于AEA，而不是2-AG(Kim和Alger，2010)，研究人員通過證明利莫那班和DO34都增加了o-aEPSCs的頻率，但沒有增加幅度，從而增強了研究人員的PPR實驗，證實了這些突觸上的強直的2-AG-CB1信號(圖3I-3K)。這些數據為BLAplPFC突觸廣泛表達的多模態(tài)強直相2-AG介導的突觸前神經遞質釋放的調節(jié)提供了證據。為了檢查ECB信號在plPFC中的輸入特異性，研究人員在檢查MDT向plPFC的投射時進行了相同的關鍵實驗。眾所周知，MDT具有低CB1的表達，因此，研究人員幾乎沒有觀察到CP55，940誘導的oEPSC幅度的抑制和沒有DSE，這表明ECB調節(jié)plPFC中的興奮性傳遞具有電路水平的特異性。

4.     應激破壞了對BLA-plPFC互易谷氨酸能回路的2-AG抑制

在觀察到應激增加了BLA-plPFC相互回路內的突觸前釋放概率，以及進入plPFC的BLA輸入受到2-AG信號的高度調控后，研究人員接下來試圖確定應激誘導的突觸增強是否是由BLA-plPFC 2-AG信號的動態(tài)重構介導的。使用質譜，研究人員觀察到應激暴露24小時后降低了mPFC中2-AG的水平，這與之前在其他大腦區(qū)域的研究一致 (圖4A)。此外，在應激小鼠的mPFC中，花生四烯酸(AA)(2-AG水解的主要降解產物)的體積水平也顯著降低(圖4B)。這些數據表明，應激暴露可以下調mPFC中2-AG的合成，因為2-AG和AA的水平在應激暴露后都同樣降低；為了支持這一點，用MAGL抑制劑JZL184抑制2-AG水解增加了2-AG，減少了AA(圖4A和4B)。重要的是，用JZL184升高2-AG水平反轉，而用DO34降低2-AG水平會加劇EZM中應激誘導的焦慮樣行為的增加，支持2-AG信號可以雙向調節(jié)應激誘導的焦慮的概念(圖4C)。最后，研究人員發(fā)現JZL184的抗焦慮作用需要CB1受體的可用性。

研究人員接著驗證了這一假說，即應激誘導的BLA-plPFC相互回路的加強是由2-AG介導的對BLA-plPFC谷氨酸能傳遞的抑制崩潰所介導的。研究人員再次發(fā)現，應激使L2/3rAAV+神經元選擇性地增加突觸前釋放概率，表現為應激后24小時的PPR降低(圖4D和4E)。有趣的是，盡管沐浴應用DO34降低了非應激小鼠的PPR，但這種作用在應激動物中被阻斷了。此外，DO34的應用阻斷了應力誘導的PPR的進一步降低。相反，在BLA-L2/3rAAV+突觸應用JZL184對2-AG信號的藥理增強能夠以CB1依賴的方式選擇性地挽救這種應激誘導的PPR下降(圖4E和S5A)。在BLA-L2/3rAAV+突觸中，2-AG信號的藥理增強能夠選擇性地挽救這種應激誘導的PPR下降(圖4E和S5A)。最后，在2-AG時相信號方面也觀察到了類似的模式，因為應激降低了L2/3rAAV+神經元的DSE幅度，這種效應可以通過JZL184孵育而得到挽救(圖4F和4G)，這種效應依賴于應激源的強度，并在應激暴露后3天恢復。根據PPR觀察，預先應用利莫那班可以阻斷JZL184對DSE的影響。L2/3rAAV_神經元(圖4H-4K)和L5神經元(數據未顯示)未觀察到應激誘導的變化。這些數據表明，應激誘導的BLA-plPFC突觸的相位和強直2-AG信號的崩潰可能有助于應激誘導的BLA-plPFC電路的加強和隨后焦慮樣行為的表達(圖4L)。有趣的是，雌性小鼠沒有表現出應激誘導的DSE幅度的降低，這表明應激對強直性和相性2-AG信號的影響可能在性別之間有所不同。然而，DSE在2MT暴露時受損，表明2-AG信號崩潰不是應激源特有的。為了進一步支持應激誘導的2-AG-CB1對BLA興奮性輸入的調節(jié)功能崩潰，研究人員證明了應激阻斷了利莫那班和NESS增加OEPSC幅度的能力，完全阻斷了NESS降低PPR的能力，同時部分阻斷了利莫那班降低BLA-L2/3plPFC rAAV+突觸PPR的能力。

最后，研究人員的質譜數據顯示，應激暴露后mPFC的AEA水平也降低(圖S5D)。這暗示了壓力也可能損害BLA-plPFC電路的AEA調節(jié)。然而，與AEA降解抑制劑PF3845孵育，既不影響基礎PPR，也不挽救應激誘導的PPR或DSE幅度的下降，表明AEA不強烈調節(jié)BLA-plPFC谷氨酸能傳遞。此外，應激暴露不影響大麻素激動劑誘導的BLA-L2/3plPFC突觸的突觸抑制，這表明應激損害了2-AG水平，而不是影響CB1受體的敏感性。

5.     前緣DAGLa缺失增加了BLA-plPFC突觸強度和焦慮樣行為

到目前為止，數據表明，2-AG在限制從BLA到plPFC的興奮性輸入方面起著至關重要的作用，應激暴露以一種電路特異性的方式損害了這一信號的有效性，有助于應激后突觸的加強。這些數據表明，plPFC內的2-AG信號缺失可能通過增強應激后的BLA-plPFC谷氨酸能偶聯(lián)而導致焦慮樣行為的產生。為了從實驗上解決這一假設，研究人員利用了有條件的DAGLa基因敲除小鼠。研究人員首先證明了在DAGLaf/f小鼠的plPFC內立體定向注射AAV-Cre可導致plPFC中DAGLa蛋白的選擇性減少，但不能導致相鄰的邊緣下PFC(IlPFC)中DAGLa蛋白的選擇性減少(圖5A)。使用plPFC特異性的DAGLa基因敲除結合上述向BLA注射ChR2和rAAV2-TD-Tomato，研究人員發(fā)現BLA-plPFC谷氨酸能突觸的DSE顯著受損，PPR顯著下降，這概括了應激暴露后觀察到的突觸表型(圖5B-5D)。與這種應激樣突觸表型相一致的是，plPFC特異性DAGLa缺失引起了類似于應激暴露后觀察到的引起焦慮的行為表型(圖5e)。這一行為特征在暴露于壓力后持續(xù)存在，在另一組小鼠中進行了檢測，表明plPFC 2-AG信號在調節(jié)類似焦慮的行為方面發(fā)揮了關鍵作用(圖5F)。這些數據表明，受損的plPFC 2-AG信號導致BLA-plPFC谷氨酸能突觸出現應激樣突觸表型，足以誘導焦慮樣行為，概括了應激暴露的影響(圖5G)。綜上所述，研究人員的數據支持這一假設，即BLA-plPFC突觸2-AG信號的應激誘導損傷可能是將應激效應轉化為焦慮樣行為的重要機制。

6.     腦環(huán)路特異性CB1缺失增加突觸強度和應激誘導的焦慮樣行為

為了進一步鞏固2-AG-CB1信號在BLA-plPFC突觸調控應激誘導焦慮中的作用，研究人員利用內含子重組酶位點啟用組合靶向(INTRSECT)的方法，選擇性地從投射到plPFC的BLA神經元中刪除CB1受體。使用Cnr1的外顯子2被loxP位點包圍的小鼠(CB1f/f；圖S6A-S6E)，研究人員將驅動FLP重組酶和TD-番茄表達的逆行病毒注射到plPFC中，并將驅動Cre重組酶以FLP依賴的方式表達的病毒注射到BLA中。 將這兩種病毒注射到CB1f/f小鼠體內，可以預測到特異性地從plPFC投射的BLA神經元中刪除CB1受體(圖6A和6E)。使用電生理方法，研究人員首先證明了這種方法可以幾乎完全從投射到plPFC的BLA神經元中去除CB1，因為與注射相同病毒組合的野生型小鼠相比，oEPSCs對大麻素激動劑CP55，940完全不敏感(圖6B)。 在BLA-plPFC特異性CB1缺失后，通過展示BLA-plPFC特異性CB1缺失后BLA-伏核突觸上完整的大麻素受體功能，驗證了該操作的電路選擇性(圖S6F-S6H)。與plPFC DAGLa缺失類似，研究人員發(fā)現BLA-plPFC特異性CB1缺失導致的突觸表型與應激后觀察到的類似，表現為PPR降低和DSE幅度降低(圖6C和6D)。接下來，研究人員確定了BLAplPFC特異性CB1缺失在基線和壓力暴露后的行為后果(圖6E和6F)。在壓力暴露之前，與對照病毒(BLA中的plPFC rAAV-td-Tomato與fDIO-Cre-mNeonGreen結合)注射的CB1f/f窩產仔相比，BLAplPFC特異性CB1缺失并不影響EZM中的焦慮樣行為(圖6G)。 然而，在同一組小鼠的EPM中，從BLA-plPFC途徑缺失CB1在足擊應激暴露24小時后增加了焦慮樣行為，這表明CB1群體在調節(jié)應激誘導的焦慮樣行為中起著關鍵作用(圖6H)�？傊�，這些數據支持研究人員的假設，即應激誘導的BLA-plPFC電路的加強是由2-AG-CB1信號中的電路特異性損傷介導的(圖6I)。

參考文獻:

1.    David J. Marcus, Gaurav Bedse, Andrew D. Gaulden, James D. Ryan, Veronika Kondev, Nathan D. Winters, Luis E. Rosas-Vidal, Megan Altemus, Ken Mackie, Francis S. Lee, Eric Delpire, Sachin Patel. Endocannabinoid Signaling Collapse Mediates Stress-Induced Amygdalo-Cortical Strengthening. Neuron, 2020; DOI:10.1016/j.neuron.2019.12.024

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