激光應(yīng)用中的濾光片和反光鏡
在熒光應(yīng)用中使用激光作為照明光源需要特別注意光路的問題。需要特別注意的地方集中在光的相干性、小的光束直徑、光偏振以及光功率。在一些情形下，錐體角(入射角)、系統(tǒng)中存在的散射都是在光路設(shè)計中需要考慮的重要影響因素。雖然光路設(shè)計中需要對整個光路考慮周全，但這篇文章將著重講解在光路中使用到的濾光片和分光鏡。
在經(jīng)典的仰角位置光照配置中有3種光件扮演著重要角色，分別是：激發(fā)片，二向色鏡/分光鏡、發(fā)射片。通常這些鏡片被安裝在一個立方盒底座上，這個底座可以根據(jù)需要插入或者從顯微鏡上移除。
在這個標準的熒光顯微鏡范例中，激發(fā)片可以阻斷所有從深紫外到近紅外波段的非熒光染料激發(fā)波段的光。通常這是一個具有30到60納米半峰全寬(FWHM)的帶通濾光片。在標準的顯微鏡中，這些鏡片沒有表面平整度規(guī)格或透射波陣面的要求。楔可以很大(通常是少于8弧分)，劃痕/戳的規(guī)格最小是80/50�？梢杂行〉綗o法衡量或觀察不到的針孔。通常這里不用過分擔(dān)心樣品自發(fā)熒光的問題，因為這個鏡片被放置在成像路徑之外。這個鏡片通常來講不是增透鍍膜的并且采用浮法玻璃作為基片。這些激發(fā)片都是零度入射角設(shè)計的。
與epi平臺相比，激光系統(tǒng)盡管大多數(shù)使用的還是上面列出的三種鏡片但是他們的配置差異極大。這些濾光片和鏡片通常并一定安裝在一個底座/立方盒上，它們在光路中的位置也是根據(jù)系統(tǒng)的不同而變化。
在激光的應(yīng)用中，大多數(shù)濾鏡的規(guī)格要求有明顯不同。純化濾光片(用于激光的激發(fā)片)必須僅對來自激光的不需要的波段有過濾作用�，F(xiàn)在還有很多用戶認為激光不需要純化濾光片，這不是正確的。幾乎所有的等離子體激光器會產(chǎn)生多條不同功率的譜線，并且新一代的二極管發(fā)射譜具有更寬的半峰全寬。此外，它們也可能會有遠離主要譜線的噪聲。二極管泵浦固態(tài)激光器在它們的輸出中通常會有非常窄發(fā)射譜，但是它有可能被泵浦源或主要譜線所污染。由于這些原因，所有的激光系統(tǒng)都要進行有或沒有純化濾光片時的信噪比檢測。透射波陣面必須優(yōu)于每英寸一個波，盡管有些應(yīng)用中的要求是每英寸1/4個波或者更好。楔必須小，一個弧分以內(nèi)，且沒有針孔。必須事先考慮到樣品的自發(fā)熒光，并且必須劃痕/戳的規(guī)格不低于60/40。這些濾鏡通常具有10-20納米的半峰全寬，是經(jīng)打磨和拋光過的，并且在任一面都是增透鍍膜，而不是干涉鍍膜。盡管標準的激光應(yīng)用使用浮法玻璃作為基片效果非常好，拉曼技術(shù)以及其它的應(yīng)用可能需要用熔融石英玻璃來消減光路中可能存在的任何自發(fā)熒光的。純化濾光片被設(shè)計成適合于3-5度的入射角以確保反射的激光不會回到激光震蕩腔中。如下圖1。
配置中的第二種鏡片是二向色鏡，也叫做分光鏡，在廣義的epi系統(tǒng)中它通常會有如下規(guī)格：少于每英寸10波的表面平面度，少于每英寸1個波的透射波陣面，少于或等于一弧分的楔，40/40的劃痕/挖痕。二向色鏡應(yīng)該用熔融石英玻璃制成，因為它被放在epi系統(tǒng)的激發(fā)路徑和反射路徑中。對于標準的應(yīng)用，這種鏡片不需要是增透鏡片。這些鏡片被設(shè)計成長通濾光片(反射短波光而透射長波光)或者短通濾光片(透射短波光而反射長波光)。在標準的顯微鏡配置中二向色鏡被設(shè)計成45度的入射角從而使得激發(fā)光的角度改變90度。
在激光應(yīng)用中，分色鏡有更嚴格的規(guī)范要求：在鍍膜之前有小于每英寸1/2個波的表面平面度，小于1/4個波的透射波面畸變，小于5弧秒的楔，以及通常為40/20的劃痕/挖痕。所有的激光鏡片都需要增透鍍膜以減少激光的二次反射和散射，同時增強透射。大多數(shù)商業(yè)用的顯微鏡號稱是1毫米厚的二向色鏡，這就要使用較厚的熔融石英玻璃才能更容易滿足這些要求。由于以上原因，激光應(yīng)用系統(tǒng)常常會使用較厚的鏡片/二向色鏡。當(dāng)大多數(shù)的激光鏡片被設(shè)計成45度入射角時，一些當(dāng)前流行的甚至更新版本的共焦顯微鏡使用10-15度入射角鏡片來增加反射率(即增加阻塞)以及使偏振影響最小化。所有以上的規(guī)范都被認為是最低限度的要求，因為在某些應(yīng)用中還要求這些鏡片達到更高的標準。
二向色鏡需要考慮的另外一個因素是激光的偏振。鏡片的設(shè)計要求在零度入射角下沒有偏振，但是任何一個鏡片在一定的入射角下都有著起偏器的作用，入射的角度取決于具體的設(shè)計。因此，所有激光鏡片都需要考慮激光的偏振性質(zhì)。見圖2。
對于分色鏡需要考慮的另一個要素是在任何基片例如熔融石英玻璃上鍍膜都會產(chǎn)生應(yīng)力。這種應(yīng)力可能很小以至于不易察覺，但確足以在光束中導(dǎo)致極端的散光。較厚的基片基本能夠幫助解決這個問題，但僅僅靠它還有可能不夠。因此，多數(shù)制造商會有專門的辦法來中和這種應(yīng)力，并且這些鏡片的反射特性也要嚴格兼顧到。需要注意的是透射波陣面是依賴于基片的外表面的平整度，通常不受任何涂層的影響。
導(dǎo)致產(chǎn)生應(yīng)力的另外一個可能原因是安裝該鏡片到系統(tǒng)中的方法。放置該鏡片的45度卡座的表面應(yīng)該被拋光得類似于基片的表面平整度(例如每英寸1/2個波)，并且任何支撐該鏡片在其位置上的物體不能產(chǎn)生任何不均的壓力。這些影響在TIRF(全內(nèi)反射顯微鏡)中是最明顯的，并且可能會要求用一個完全定制的的立方體底座來代替標準的顯微鏡底座。
發(fā)射片是配置當(dāng)中的最后一種鏡片了，也經(jīng)常被叫做隔紫外濾光片。該鏡片的主要功能是阻止激發(fā)波段光到達探測器(人的眼睛或是電子探測設(shè)備)。它的第二個功能是透射來自目標染料的所需熒光。這就意味著發(fā)射片必須高消光阻塞任何透過激發(fā)片的光。阻塞通常是用光密度(OD)來衡量，它是透過率(T)的對數(shù)，在廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域它的取值范圍在OD 3到OD 6之間。這種鏡片要么是帶通的，要么是長通的，其典型的規(guī)格要求為：小于每英寸1波的波陣面，小于一弧分的楔，60/40的劃痕/挖痕。增透鍍膜可以根據(jù)特殊的應(yīng)用進行選擇。
對于激光應(yīng)用，對發(fā)射片的最低要求就跟上面定義也很接近，除了一點，對激光束的阻塞應(yīng)該最小為OD 6，并且在所有的情況下都應(yīng)該使用增透鍍膜。這些發(fā)射片也被設(shè)計成0-5度的入射角，就像許多現(xiàn)代的寬場系統(tǒng)一樣，以減少內(nèi)部的反射。如下圖3。
此外，在一些特殊的應(yīng)用中還需要考慮更多的問題。
標準的激光掃描共焦系統(tǒng)
典型的激光掃描單元要求滿足上面列出的規(guī)范同時還需要考慮發(fā)射片是放在轉(zhuǎn)輪中還是分流單元中。如果共聚焦顯微鏡只有一個探測器(通常是一個PMT)或使用發(fā)射片轉(zhuǎn)輪來順序成像，那么用于每一個激光束的發(fā)射片必須只能過濾那一束激光。多探測器系統(tǒng)則使用發(fā)射分光二色鏡來控制光線。這些分色鏡不需要比普通鏡片滿足更多的規(guī)格要求，但是在一些應(yīng)用中需要有增透鍍膜來保證成像質(zhì)量。
就像上面提及到的，一些新一代的激光掃描單元使用一個普通二向色鏡，其入射角不是45度而可能是10-15度，但是，分光二向色鏡通常是45度入射角。
多針孔共聚焦顯微鏡
目前的商業(yè)Nipkow Disk共聚焦顯微鏡有兩個完全不同的光束路徑。一個是使用初級的分色鏡來反射激光因此它非常類似于標準的共聚焦配置。另一個類型是使用初級分色鏡來傳輸激光到樣本上，然后再反射這些激發(fā)光到探測器上(通常是CCD攝像機)。多個原因都使得這類透射分色鏡的設(shè)計非常困難。二向色鏡在一定程度上更難設(shè)計和制造是因為要求具有非常窄的透射波段和寬的反射波段。這種設(shè)計意味著甚至多得多的激光最終會被反射到探測器上(也在不同的角度)，因此就需要特別強調(diào)發(fā)射片的過濾能力。由于這些透射鏡片是放置在光程的聚焦路徑中，基片的厚度是受到限制的，這使得波陣面畸變控制變得更加復(fù)雜。如圖4所示。
全內(nèi)反射熒光顯微鏡，TIRF
全內(nèi)反射熒光顯微鏡最初的設(shè)計是使用棱鏡使激光束射到細胞粘附的交界處。這樣做存在著經(jīng)常需要校準的問題，但是從濾波片的角度來看，它更直截了當(dāng)，因為被反射的激光不會被物鏡收集。然而，后來發(fā)展的通過鏡頭取景式的全內(nèi)反射熒光顯微鏡帶來了不一樣的環(huán)境條件，即激光激發(fā)光事實上被物鏡吸收了。因此，激光可以毫無損耗地被反射回光路中。反射光線要求全內(nèi)反射熒光顯微鏡應(yīng)用中的二向色鏡和發(fā)射片能夠處理大量的反射激光。激光會給任何往顯微鏡中看的人造成危險，因此它通常被激光遮擋設(shè)備過濾掉。
就像之前提到的，全內(nèi)反射熒光鏡應(yīng)用中的二向色鏡的反射波陣面畸變(RWD)必須滿足相當(dāng)嚴格的標準，通常是以表面平整度為每英寸0.1波和透射波面畸變?yōu)槊坑⒋?/SPAN>0.1波的基片開始。必須非常注意使用的鍍膜不要給基片帶來超過可接受水平以外的壓力。由于系統(tǒng)可能會變化，這項要求可以是在鍍膜之后每英寸0.25到1個波的表面平整度。
在全內(nèi)反射熒光顯微鏡設(shè)備中，發(fā)射片的阻塞必須大于OD 6，并且在許多應(yīng)用中甚至要達到OD 8。僅在幾年前，這還被認為是不可能的，但由于使用了高級的鍍膜技術(shù)和非常特殊的訣竅之后，現(xiàn)在已經(jīng)是相當(dāng)普遍了。
系統(tǒng)設(shè)計造成的高角度反射使得全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像相當(dāng)復(fù)雜，因為干涉濾波片都被設(shè)計成0-5度的入射角。超過了這些圓錐角的光線會使濾波片的cut-on朝向紫外方向偏移，即朝向激光源。因此，此類系統(tǒng)中的高角度激發(fā)光要求發(fā)射片具有一定的cut-on紅移來避免上述想光源的偏移效應(yīng)同時還保持完整的阻塞能力。在這種情境下的另外一個選擇是使用吸收玻璃，它不依賴于角度變化，但是能大大降低濾波片的透射率。
在目前的通過鏡頭取景式的全內(nèi)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)中，在立方盒(底座)中或靠近鏡片二色鏡中使用發(fā)射片是非常普遍的，并且在探測器發(fā)射片轉(zhuǎn)輪前面放置第二個發(fā)射片。在立方盒中放置一個好的阻塞發(fā)射片也大大增加了安全系數(shù)，以防止某人意外地在沒有激光鎖的情況下向顯微鏡中看過去而受傷。這種雙保險的發(fā)射設(shè)計在一些系統(tǒng)下是絕對有必要的，但在另外的系統(tǒng)中就不一定。這里需要說明的是標準的非常窄的凹口濾光片在這些應(yīng)用中效果不是非常好，因為這種類型的濾光片對入射光的角度非常敏感。如下圖5和圖6。
多光子系統(tǒng)，三分之二激光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)
發(fā)展?jié)M足早期的理論參數(shù)的雙光子成像系統(tǒng)(通過使用高功率脈沖激光在兩杯激發(fā)波長處激發(fā)熒光基團)，對于濾光片生廠商而言存在很大的技術(shù)難題。對于這些系統(tǒng)，在非掃描模式下，主要的鏡片應(yīng)該是短通設(shè)計的，即反射長波長的波段而透射短波長的波段。這種鏡片必須被設(shè)計得反射和透射的效率都相當(dāng)高，并且保證入射的脈沖光線沒有任何的色散，因為這會明顯降低峰值的功率。這種新技術(shù)也意味著這些系統(tǒng)中的阻塞濾光片對波長較長的波段有最大化的阻塞效果，而單光子激光顯微鏡恰好相反要在短波有較好的阻塞作用。全新的濾光片設(shè)計必須是長時間不斷的研發(fā)和完善以滿足目前要求在全部參數(shù)調(diào)整范圍內(nèi)的激光的阻塞達到的OD 8+的水平。如下圖7。
為了深入完善濾光片的設(shè)計，許多人想使用二次諧波(SHG)成像和做3光子激發(fā)，這些都要求二向色鏡和發(fā)射片能夠透射紫外范圍的光。這可能是設(shè)計中最困難的一部分，但現(xiàn)已通過干涉技術(shù)來實現(xiàn)。如圖8。
有更多的用戶使用非再掃描探測(NDD)系統(tǒng)，發(fā)射信號不通過主要的分色鏡。這些系統(tǒng)通常直接將熒光從樣本傳輸?shù)教綔y器。在光路開始的位置(見圖7、圖8)，探測器或者是多探測器系統(tǒng)中的每一個探測器的前面安裝帶通發(fā)射片，可能會是一個短通發(fā)射片，來阻塞激光。這些通常被安裝在立方盒底座上以簡化光束路徑。如圖9。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微技術(shù)
這種新技術(shù)，得到了哈佛大學(xué)謝曉亮(SunneyXie)博士的支持，是一種要求有包含多種波長泵浦激光和斯克托斯激光的成熟多光子應(yīng)用。由于這些激光功率巨大，可能還需要另外的阻塞能力，可能要超過上面提到的標準雙光子系統(tǒng)中OD 8+的水平，并且連續(xù)使用兩個阻塞鏡片的情況也非常普遍。如下圖10。
拉曼光譜
拉曼光譜
拉曼技術(shù)已經(jīng)存在很多很多年了。目前最常見的是被應(yīng)用在關(guān)于長波激光的正斯克托斯拉曼信號上(使用長通二向色鏡和長通發(fā)射片)。有時候，研究者更喜歡看負的斯克托斯拉曼反應(yīng)(使用短通二向色鏡和帶通或短通發(fā)射片)。每一種應(yīng)用都需要特殊的鏡片或濾光片，但是主要的要求是盡最大努力阻塞激光，因為拉曼信號非常低。通常拉曼信號太低，所以光學(xué)鏡片包括純化濾光片和發(fā)射片必須采用熔融石英玻璃而不是浮法玻璃制作，以減少系統(tǒng)中出現(xiàn)的任何的自發(fā)熒光。此外，二向色鏡和發(fā)射片還必須被設(shè)計得盡量靠近激光束。幸運地是，許多正的斯克托斯實驗?zāi)軌蚴褂瞄L通發(fā)射片，這種發(fā)射片更容易設(shè)計成離激光束只有幾毫微米，并且仍然能獲得最佳的激光過濾效果。如圖11。
激光阱和光鑷
通常，這些系統(tǒng)使用一個1064納米的激光束或者類似聚焦束照射標本平面。為了達到這個目的，大多數(shù)的系統(tǒng)使用一個能反射近紅外光(NIR)和透射可見光的長通分色鏡。此外，所有的發(fā)射片必須能夠阻塞激光阱，就像上面描述的類似于雙光子的阻塞。如圖12。
流式細胞術(shù)
由于流式系統(tǒng)使用激光器，即使一些規(guī)格由于這些機器固有的能力通過在其計算中使用激光光散射和激發(fā)光來消除噪音得以放寬，他們也需要特別考慮。這些系統(tǒng)不使用成像組件通常是不能成像的。流式細胞儀光學(xué)檢測技術(shù)的最大的挑戰(zhàn)之一就是從越來越多的熒光染料中同時收集信號所帶來的困難。這就意味著二向色鏡(可能是長通也可能是短通，這要取決于設(shè)備的設(shè)計)和發(fā)射片在相同的發(fā)射路徑中可能被設(shè)計成適合4到6種不同的熒光染料。這就迫切需要將分色鏡設(shè)計得非常陡，并且陡而窄的發(fā)射片設(shè)計還必須滿足市場上不同流式系統(tǒng)一般化設(shè)計的要求。完整的流細胞術(shù)應(yīng)用的內(nèi)容可以在網(wǎng)站www.chroma.com上查看。
總結(jié)
總而言之，激光鏡片必須被設(shè)計成不同于標準的寬場濾光片和鏡片。盡管事實上大多數(shù)的激光鏡片在寬場應(yīng)用中非常好，單反過來卻不一定正確，就像上面講到的案例中的不同規(guī)范。在每一個激光應(yīng)用中，設(shè)計和構(gòu)造的不同對于最終的用戶而言不會太明顯。然而，在大多數(shù)實驗中，如果這些規(guī)格要求不被滿足，那么這些不同將會明顯令人感覺到痛苦，特別是在要求更多的應(yīng)用中，例如全內(nèi)反射熒光顯微鏡，拉曼顯微鏡和多光子顯微鏡。
總而言之，激光鏡片必須被設(shè)計成不同于標準的寬場濾光片和鏡片。盡管事實上大多數(shù)的激光鏡片在寬場應(yīng)用中非常好，單反過來卻不一定正確，就像上面講到的案例中的不同規(guī)范。在每一個激光應(yīng)用中，設(shè)計和構(gòu)造的不同對于最終的用戶而言不會太明顯。然而，在大多數(shù)實驗中，如果這些規(guī)格要求不被滿足，那么這些不同將會明顯令人感覺到痛苦，特別是在要求更多的應(yīng)用中，例如全內(nèi)反射熒光顯微鏡，拉曼顯微鏡和多光子顯微鏡。
C. Michael Stanley, PhD.
Senior Applications Scientist
Chroma Technology Corp.
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