大鼠短暫腦缺血術(shù)后行為學(xué)的評價
摘 要: 目的 觀察大腦中動脈阻塞(MCAO) 2 h造成的短暫腦缺血大鼠(MCAO大鼠)行為學(xué)表現(xiàn)。方法 采用插線法阻塞成年SD大鼠大腦中動脈制作短暫腦缺血模型,分別對模型大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)、四肢協(xié)調(diào)性及學(xué)習(xí)記憶能力檢查;術(shù)后第14天處死大鼠取腦組織進行四氮唑紅(T TC)染色鑒定模型的成功與否。對照組不進行動脈阻塞。結(jié)果 術(shù)后1 h至第14天, MCAO 大鼠與對照組比較,在神經(jīng)行為學(xué)、協(xié)調(diào)性及學(xué)習(xí)記憶能力等方面均有明顯的缺失和障礙( P< 0101) 。結(jié)論 采用插線法制作的大鼠短暫腦缺血模型操作簡單;術(shù)后動物行為學(xué)實驗是1種半定量分析,具有敏感、客觀的特點,能夠廣泛應(yīng)用于各種實驗研究。
關(guān)鍵詞: 大腦中動脈阻塞; 短暫腦缺血; 行為學(xué); Y迷宮實驗
缺血性腦血管病約占所有腦血管病的70 % ,與其他腦血管病相比,具有“三高一低”的特點,即高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、低死亡率。我國每年新發(fā)病人數(shù)120萬～150萬,幾乎所有的病例均遺留不同程度的殘疾。從經(jīng)濟學(xué)、社會學(xué)角度考慮,缺血性腦血管病對人類的威脅較其他類型的腦血管病更大。因此,對缺血性腦血管病而言,迫切需要尋找合理有效的治療措施。目前,對于神經(jīng)細胞凋亡的研究多數(shù)來源于廣泛或局部腦缺血的動物模型,此模型的病理改變同人類的腦中風(fēng)相類似,是一種較為成熟的動物模型,被廣泛應(yīng)用于各種實驗研究中。通過對大腦中動脈的有效阻塞后的再灌注,使腦中特定部位發(fā)生壞死和凋亡。
本實驗試圖通過建立缺血2 h的大鼠短暫腦缺血模型,從大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)和學(xué)習(xí)記憶能力兩方面對該模型作出評價,從而為進一步的治療效果提供合理的評價依據(jù)。
1 材料與方法
111 材料
雌性SD大鼠24只,體質(zhì)量250～300g ,由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。隨機分為2組: MCAO 大鼠12只,對照組12只。對照組只做手術(shù)但不插線栓塞血管。112 制備大鼠左側(cè)大腦中動脈栓塞模型大鼠用10 %水合氯醛麻醉(013 ml/ 100g) ,仰臥位取頸部正中切口,暴露頸總動脈、頸內(nèi)動脈 、頸外動脈和翼腭動脈 。距頸總動脈分叉部10 mm處將頸外動脈用3 - 0絲線結(jié)扎;用3個動脈夾分別夾閉頸總動脈、頸內(nèi)動脈和翼腭動脈。用1 ml注射器在頸外動脈上刺1個小孔(在頸外動脈結(jié)扎處至頸總動脈分叉部之間) ,用30 mm長、4 - 0尼龍線(尖端燒成圓形,以免刺破血管內(nèi)壁)經(jīng)此小孔插入,松開頸內(nèi)動脈上的動脈夾,將插線經(jīng)頸總動脈分叉處插入頸內(nèi)動脈直至堵塞住大腦中動脈(從頸總動脈分叉處插入線長18～20 mm) 。90 min后,拔出插線。近心端結(jié)扎頸外動脈,松開頸總動脈和翼腭動脈上的動脈夾,肉眼可見血管內(nèi)血流恢復(fù)。分層縫合手術(shù)切口,注意動物保暖。
113 行為學(xué)實驗
11311 神經(jīng)行為學(xué)檢查:神經(jīng)學(xué)缺失于大鼠缺血和再灌注后不同的時間段進行。具體時間為缺血后再灌注6 h , 1、2、3、7、10、14 d。2組大鼠隨機取6只,神經(jīng)學(xué)檢查標(biāo)準(zhǔn)按照Lo nga等提出的進行評分: 0 分為正常; 1 分為栓塞動脈對側(cè)上肢不能完全伸展,而同側(cè)上肢正常; 2 分為栓塞動脈對側(cè)上肢屈曲,向?qū)?cè)推時抵抗力下降,沒有旋轉(zhuǎn); 3 分為栓塞動脈對側(cè)上肢屈曲,向?qū)?cè)推時抵抗力下降,行走時向?qū)?cè)有輕度旋轉(zhuǎn); 4 分表現(xiàn)為行走時向?qū)?cè)有嚴(yán)重旋轉(zhuǎn); 5 分為大鼠身體倒向梗死對側(cè)。
11312 攀繩實驗:本實驗主要檢查大鼠雙前肢和雙后肢的協(xié)調(diào)配合能力。實驗于手術(shù)后2、3、7、10、14 d后進行。為完成實驗,大鼠需要具有運動學(xué)習(xí)的能力。取直徑115 cm的麻繩從高1 m、長和寬分別為1 5、5 0 cm的平臺上垂下,手術(shù)前1 d訓(xùn)練每只大鼠,使之能夠爬到繩子的上1/ 3。
從術(shù)后第2天開始,每個測試日測試3次。評分的標(biāo)準(zhǔn)如下: 0 分,不需任何刺激在10 s內(nèi)爬上平臺; 1 分,不需任何刺激在15 s內(nèi)爬上平臺; 2分,刺激次數(shù)小于5次,在30 s內(nèi)爬上平臺; 3分,刺激次數(shù)小于5次,在60 s內(nèi)爬上平臺; 4分,刺激次數(shù)大于5次,在60 s內(nèi)爬上平臺或是刺激小于5次,但爬上平臺時間超過60 s ; 5分,大鼠不能爬上平臺。
11313 Y迷宮學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練及測試:動物分為3組, A、B 2組隨機取3只大鼠,另取3只同樣規(guī)格的正常大鼠作為對照。分別于手術(shù)后第3、4、1 4天 進 行 試 驗 。Y型 電 迷 宮 臂 長3 0 cm ,高1 5 cm ,寬1 5 cm。每臂末端有1 5 W信號燈示安全區(qū),箱底銅柵間隔4 mm。電流強度017 mA ,選用電壓38 V ,電擊延時2 s。設(shè)一臂為起步區(qū),按 Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂順序輪流作為安全區(qū)。大鼠在起步區(qū)靜置3 min ,予以電擊致其逃至安全區(qū),燈光持續(xù)15 s ,然后熄燈休息45 s ,開始下一次操作。學(xué)習(xí)訓(xùn)練及測試:規(guī)定大鼠受電擊后從起步區(qū)直接逃至安全區(qū)為“正確反應(yīng)”,以達到連續(xù)10次電擊均為正確反應(yīng)(即10/ 10)前所需的電擊次數(shù)(即嘗試次數(shù))表示其學(xué)習(xí)獲得能力(acquisi2tio n)。若嘗試次數(shù)超過30次則不再測試,并以30次為最大值計數(shù)。記憶再現(xiàn)(ret rieval)測試:選上述達到10/ 10標(biāo)準(zhǔn)的大鼠,休息24 h后再次同法測試,以達10/10標(biāo)準(zhǔn)前的嘗試次數(shù)表示記憶再現(xiàn)能力。
114 TTC染色
大鼠MCAO手術(shù)第14天, A、B組分別隨機取6只動物,用水合氯醛過量麻醉處死(500 mg/ k腹腔注射) ,經(jīng)心臟灌注生理鹽水。在大腦耳間線前1 2 mm(為 額 葉 皮 質(zhì) 的 感 覺 和 運 動 區(qū)) 至510 mm(為海馬中部)處切成腦片,片厚1 mm ,然后將腦片放入4 %四氮唑紅(2 , 3 , 5Ot rip henyltet razoliumchloride , T TC)磷酸鹽緩沖液中,3 7 ℃避光孵育30 min ,取出置于10 %多聚甲醛液中固定,拍照。
2 結(jié) 果
211 鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評分術(shù)后1h至第14天MCAO組大鼠和對照組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)相比較, 對照組明顯好于MCAO組 。2者 在 多 個 時 間 段 都 有 顯 著 差 異( P< 0101) , 隨著術(shù)后時間的推移,手術(shù)組大鼠的癥狀有所改善,但評分始終在2分以上,明顯存在不可逆的神經(jīng)行為學(xué)損傷212 攀繩實驗結(jié)果術(shù)后第2～14天MCAO組大鼠和對照組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)相比較,對照組明顯好于MCAO組。2者在多個時間段都有顯著行差異( P <0101) , 隨著術(shù)后時間的推移, MCAO 組大鼠的癥狀有所改善,但評分始終在3分以上,明顯存在不可逆的神經(jīng)行為學(xué)損傷(圖2) 。
213 Y迷宮試驗
Y迷宮測試結(jié)果顯示, MCAO 組大鼠在各個時間段在學(xué)習(xí)記憶能力方面均明顯低于對照組
( P < 0101)。
214 T TC染色的結(jié)果大鼠術(shù)后第14天, T TC 染色的結(jié)果顯示:MCAO組大鼠的腦組織梗死灶明顯,對照組腦組織沒有明顯梗死灶(圖4) 。
3 討 論
本實驗通過插線法制作大鼠短暫腦缺血模型,來觀察大鼠的神經(jīng)行為學(xué)能力、四肢協(xié)調(diào)功能和學(xué)習(xí)記憶能力3方面的損傷情況。從術(shù)后1 h至第14天,在大鼠神經(jīng)學(xué)評分、攀繩實驗和Y迷宮實驗中,均發(fā)現(xiàn)與對照組大鼠的顯著性差異( P< 0101) 。盡管隨著手術(shù)后時間的延長,這3項指標(biāo)均有所好轉(zhuǎn),但與對照組大鼠相比,差異始終具有顯著性,說明了腦損傷的不可逆性。在手術(shù)后第14天,處死大鼠進行腦組織T TC染色顯示了腦梗死體積仍然較大。梗死病灶的存在是大鼠行為學(xué)功能損傷的直接證據(jù)。本實驗所采用的攀繩實驗曾被作為評價酒精中毒動物的行為學(xué)損傷和評價外傷性腦損傷動物的行為學(xué)改變的依據(jù)。實驗動物在攀繩中的良好表現(xiàn)不但需要四肢的配合協(xié)調(diào)能力,而且還必須具有足夠的運動學(xué)習(xí)能力。本實驗中在14 d內(nèi)5次進行測試,腦缺血大鼠在攀繩實驗中的表現(xiàn)有明顯的進步,而有研究證實2周或4周測試1次顯示大鼠的行為學(xué)改善不明顯。這表明損傷后的功能鍛煉將有助于神經(jīng)功能的恢復(fù)。在靈長類動物中亦有類似的報道, 合理的解釋是損傷后的功能鍛煉能夠促進大腦皮質(zhì)神經(jīng)元神經(jīng)突觸的連接形成。目前,有關(guān)短暫局灶腦缺血對大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響報道不一。有的學(xué)者認(rèn)為MCAO手術(shù)只造成腦組織紋狀體和皮層的損傷,而海馬組織不受影響,因此記憶能力不受影響; 有人認(rèn)為大鼠腦中參與學(xué)習(xí)和記憶的部位不僅限于海馬,皮層尤其是頂葉皮質(zhì)在動物的學(xué)習(xí)和記憶過程中起到非常重要的作用。而MCAO手術(shù)后會造成頂葉皮層的損傷,故會導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低。本實驗中Y迷宮測試結(jié)果與對照組比較顯示腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力在手術(shù)后第3～14天顯著降低( P < 0101) 。作者認(rèn)為,除了頂葉皮質(zhì)損傷影響記憶功能外,可能的原因還有大鼠腦缺血過程中伴隨著大量炎性因子的釋放,包括氧自由基、一氧化氮等, 這些炎性因子的擴散會造成海馬組織的損傷從而影響記憶功能,但并沒有造成海馬組織顯著的病理學(xué)改變。綜上所述,本實驗采用插線法制作的大鼠短暫腦缺血模型操作簡單,效果可靠;術(shù)后動物行為學(xué)實驗是一種半定量分析,具有敏感、客觀的特點,能夠廣泛應(yīng)用于各種實驗研究。
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