可溶性抗原(soluble antigen)的制備及鑒定
關(guān)鍵詞：可溶性抗原可溶性抗原solubleantigen糖蛋白脂蛋白細(xì)胞勻漿
蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸等均為可溶性抗原，它們有相當(dāng)部分來源于組織和細(xì)胞，成分復(fù)雜。制備這類免疫原時(shí)，首先須將組織和細(xì)胞破碎，然后再從組織和細(xì)胞勻漿中提取目的蛋白或其他抗原，提純的抗原需鑒定后才能用做免疫原。
一、組織勻漿的制備
用于制備免疫原的材料必須是新鮮或低溫保存的。材料獲得后立即去除包膜或結(jié)締組織，臟器應(yīng)進(jìn)行灌洗，去除血管內(nèi)殘留的血液，用含0.5g/L NaN3的生理鹽水洗去血跡及污物；在4℃水浴或冰浴中將洗凈的組織剪成0.3～0.5cm3小塊，加入適量生理鹽水，放入用組織研磨機(jī)（OMNIBead Ruptor 24 多樣品研磨珠均質(zhì)儀）制成組織勻漿。組織勻漿經(jīng)3000r/min離心10min后，上清液作為提取可溶性抗原的材料。上清液在提取前還必須進(jìn)行離心去除細(xì)胞碎片及微小的組織。
二、細(xì)胞破碎
提取細(xì)胞的可溶性抗原，需將細(xì)胞破碎。根據(jù)細(xì)胞類型不同，選擇破碎的方法也有一定的差異，現(xiàn)介紹幾種常用的細(xì)胞破碎方法。
1、酶處理法
溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等在一定的條件能消化細(xì)菌和組織細(xì)胞。如溶菌酶對(duì)革蘭陽性菌的細(xì)胞壁有溶菌作用。酶處理法適用于多種微生物細(xì)胞的溶解，該方法具有作用條件溫和、內(nèi)含物成分不易受到破壞、細(xì)胞壁損壞程度可以控制等特點(diǎn)。
2、凍融法
細(xì)胞主要因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度突然改變而破壞。其方法是將破碎的細(xì)胞置-15～-20℃冰箱內(nèi)完全凍結(jié)，然后從冰箱取出，讓其在30～37℃中緩慢融化。如此反復(fù)兩次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆�？杀黄�。此法適用于組織細(xì)胞，對(duì)微生物的細(xì)胞作用較差。
3、超聲破碎法
這是利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)而使細(xì)胞破碎的一種方法。由于超聲波發(fā)生時(shí)的空腔作用（cavitation），使液體局部減壓，引發(fā)液體內(nèi)部流動(dòng)，在漩渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大的壓力而使細(xì)胞破碎。超聲波所使用的頻率從1～20kHz不等。進(jìn)行超聲破碎時(shí)，需間歇進(jìn)行，避免長時(shí)間超聲產(chǎn)熱，導(dǎo)致抗原破壞。也可將超聲粉碎的細(xì)胞置于冰浴降溫。超聲破碎細(xì)胞，方法簡單，重復(fù)性較好，且節(jié)省時(shí)間。微生物和組織細(xì)胞的破碎，均可采用此方法�？蛇x用超聲波細(xì)胞破碎儀(OMNI Sonic Ruptor400W)
4、表面活性劑處理法
在適當(dāng)?shù)臏囟�、pH及低離子強(qiáng)度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，通過細(xì)胞膜的通透性改變使細(xì)胞溶解。常用的表面活性劑有十二烷基磺酸鈉（SDS陽離子型），新潔爾滅，Triton X-100等。如將大腸桿菌濕菌體1g，加入2%濃度的Triton X-100作用60min，可使絕大多數(shù)大腸桿菌的菌體裂解。此方法作用比較溫和。在提取核酸時(shí)，常用此法破碎細(xì)胞。
三、蛋白質(zhì)的提純
蛋白質(zhì)純化方法屬于生物化學(xué)技術(shù)，本章只作較簡要介紹。
1、超速離心法
此法分離和純化抗原的原理是利用各顆粒在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的顆粒處于不同密度梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。常用的密度梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油、CsCl等。
用超速離心或梯度密度離心分離和純化抗原時(shí)，除個(gè)別成分外，極難將某一抗原成分分離出來，故只用于少數(shù)大分子抗原的分離，如IgM、C1q，甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質(zhì)如載脂蛋白A、B等。多數(shù)的中、小分子量蛋白質(zhì)采用此種方法很難純化。
2、選擇性沉淀法
其原理多根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。最常用的方法是鹽析沉淀法。
鹽析法的原理
蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)分子表面離子周圍的水分子數(shù)目，亦即主要是由蛋白質(zhì)分子外周親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。由于各種蛋白質(zhì)在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的蛋白質(zhì)不同，從而使之從其他蛋白分離出來。最常用的鹽溶液是33%～50%飽和度的硫酸銨。鹽析法簡單方便，可用于蛋白質(zhì)抗原的粗提，丙種球蛋白的提取，蛋白質(zhì)的濃縮等。鹽析法提純的抗原純度不高，只適用抗原的初步純化。
3、凝膠層析法
凝膠層析是利用分子篩作用對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。凝膠是具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，經(jīng)過適當(dāng)?shù)娜芤浩胶夂�，裝入層析柱。一種含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，只能分布于顆粒之間，因此在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快，最先被洗脫。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較慢，隨后被洗脫。因此，蛋白質(zhì)分子按分子大小被分離。
4、離子交換層析法
離子交換層析的原理是利用一些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶的電荷量不同，與纖維素（或凝膠）結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時(shí)，逐步增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位置，從而使吸附的蛋白與離子交換劑解離。
在離子交換色譜技術(shù)中常用的離子交換劑有以下幾種
①具有離子交換基團(tuán)的纖維素，如羧甲基（CM）纖維素、DEAE-纖維素
②具有離子交換基團(tuán)的交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖和聚丙烯酰胺
③凝膠合成的高度交聯(lián)樹脂。
5、親和層析
親和層析是利用生物大分子的生物特異性，即生物大分子間所具有專一親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體、IgG和葡萄球菌蛋白A（SPA）等物質(zhì)間具有一種特殊的親和力。例如提純IgG時(shí)，可將SPA吸附在一個(gè)惰性的固相基質(zhì)（如 Speharose 2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當(dāng)樣品流經(jīng)層析柱時(shí)，待分離的IgG可與SPA發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH值，IgG與固相基質(zhì)上的SPA解離，收集洗脫液便可得到欲純化的IgG。
親和層析法純化蛋白質(zhì)抗原的主要優(yōu)點(diǎn)是純度高，簡單快捷，但成本較貴。
四、核酸抗原的制備
核酸分子具有免疫原性，可用于免疫原制備抗體。提取核酸的主要步驟是先將細(xì)胞破碎使核酸從細(xì)胞中游離出來，再用酚和氯仿抽提以去除蛋白質(zhì)，最后用乙醇沉淀核酸。
五、脂多糖抗原的制備
脂多糖（LPS）是革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的重要成分，有多種生物學(xué)效應(yīng)。通常采用苯酚法提取LPS。具體方法是：將干燥的菌體（或數(shù)量相當(dāng)?shù)臐窬w）在水中混勻，加熱至65～68℃，加入等體積預(yù)溫的苯酚，并激烈攪勻，再加熱5min，立即用冰冷水急劇冷卻降低至10℃以下，3000 rpm離心30min，使其分為兩層。上層為水層，下層為酚層，菌體殘?jiān)诘撞�。吸取水層（含LPS），經(jīng)透析除酚、濃縮、超速離心后，脂多糖位于上層沉淀的透明膠狀部分，取出懸于水中，再進(jìn)行離心，即可獲得純化的LPS樣品。
六、純化抗原的鑒定
為獲得好的免疫效果，抗原純化后應(yīng)進(jìn)行鑒定才能用于動(dòng)物免疫，抗原的鑒定主要包括以下幾個(gè)方面：
1、含量檢測(cè)
蛋白含量的測(cè)定最準(zhǔn)確的方法是凱氏定氮法，但由于要求有精密設(shè)備，故不適合一般實(shí)驗(yàn)室。一般實(shí)驗(yàn)室均采用分光光度計(jì)測(cè)量法。該法首先測(cè)定280nm 和260nm的吸光度（A），再用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算蛋白含量。
蛋白含量（mg/ml）=A280×1.45-A260×0.74。
另外蛋白含量也可采用福林酚法，具體操作見臨床生化技術(shù)。
2、分子量的鑒定
測(cè)定分子量一般采用SDS-PAGE電泳法，詳見臨床生化技術(shù)。
3、純度鑒定
常采用區(qū)帶電泳法鑒定，詳見臨床生化技術(shù)。
4、免疫活性鑒定
常采用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。
本實(shí)驗(yàn)方案采用Omni的Bead Ruptor 24 多樣品研磨珠均質(zhì)儀和Prep 多樣品均質(zhì)儀（由北京平利洋公司提供）.
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