(首先聲明，此文不如分子克隆第三版權(quán)威與分子克隆相背處，請信分子克隆)
增加PCR的特異性
1. primers design
   這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件
a  足夠長,18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量
b  GC% 40%~~~~60%
c  5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d  避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC
   e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER
   f. 避免3'端的錯配
   g. 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)
   h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補 和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們
   i. 需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)
   j. 最好學(xué)會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
* 引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。
   設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
   根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
   定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。 引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
   Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用 并能影響Polymerase的活性一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液
b. 其他的離子
   NH4+ K+都會影響PCR。增加K+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當(dāng)然, 過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時, DNA在94度根本不會發(fā)生變性, 當(dāng)然也就無從談起PCR了.
c. polymerase
   不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真沒的效率要遠遠低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性
    d. template
    50ul PCR SYSTEM  
human gDNA 0.1ug-1ug
    E.Coli 10ng-100ng
    LamadaDNA 0.5ng-5ng
    Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. termperature
a. denaturation
   常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation
b. annealing
   重點到了。一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因為, polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴增的風(fēng)險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
   原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度
94 5min
   94 30s
   60 30s
   72 1min 2cycles
   94 30s
   59 30s
   72 1min 2cycles
   94 30s
   58 30s
   72 1min 2cycles
........
   94 30s
   51 30s
   72 1min 2cycles
  94 30s
  50 30s
  72 1min 20cycles
  72 5min
6. hot start PCR
   熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法 簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。
   熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合 酶，在反應(yīng)體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣， 尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本 成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。
                ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
                Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
                Magnesium wax beads (Stratagene).
   象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
   我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105冪個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合. 當(dāng)模板的濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng). 引物容易自身進行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來了個 booster PCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以確保開始擴增的準(zhǔn)確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平
8. 循環(huán)數(shù)和長度
   確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因為過多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的積累 產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有:
1.  增加TEMPLATE
2. 增加循環(huán)數(shù)
   如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法.做一個PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個會影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate).當(dāng)然是越高 越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地
9. thermal cycler
   PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
   附加物或者說enhancer實在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子, DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量.在GC Rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.
====================================================
     dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
     formamide at 5%
     trimethylammonium chloride 10-100uM
     detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
     polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
     glycerol 10-15%
     single stranded DNA binding proteins
     Gene 32 protein 1nM
     E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
     7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
     Taq Extehder (stratagene)
     Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
    Q-solution(Qiagen)
====================================================
   要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度
11. Template DNA preparation
   提取DNA時的試劑會抑制PCR反應(yīng)的順利進行.因此需要對TEMPLATE DNA進行純化.特別是SDS(<0.01%) 的情況下就能強烈抑制PCR的進行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑制SDS. 還有proteinase K也要除干凈, 不然會降解polymerase.
12. Nested PCR
   簡單點說 設(shè)計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內(nèi)的, 用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.
                                 增加PCR的保真性
高保真酶
高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型
a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現(xiàn)的突變
   b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
   c.有DNA聚合活性,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。
酶的混合物
將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產(chǎn)量及擴增長模板。
其他因素
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。